本發明屬于微生物發酵領域，具體涉及一種促進牛樟芝菌絲體生長和活性產物合成的方法。
背景技術：
牛樟芝(antrodiacamphorat)是20世紀90年代在臺灣發現的藥用多孔菌，為臺灣特有的珍貴真菌，亦名牛樟菇、樟芝，有“臺灣森林紅寶石”之美稱。牛樟芝寄生于臺灣特有的保護樹種牛樟樹上，生長極為緩慢，自然產量稀少。作為傳統中藥材，牛樟芝的子實體和菌絲體具有安神、怯風行氣、化疲活血、溫和消積，解毒消腫及鎮靜止痛之效，為上好的防腐解毒劑；現代藥理學研究表明，牛樟芝對肝病有療效，具有抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、降血脂、降血糖等作用，是上等的食(藥)用真菌。牛樟芝的成分復雜，其中主要的活性成分包括三萜、多糖和腺苷等，三萜類化合物是牛樟芝最重要的化學成份之一，也是牛樟芝的萃取物中苦味成份的來源。
目前，自然界中牛樟樹存量不多，適合牛樟樹生長的地區有限，導致牛樟木資源稀缺；而野生牛樟芝生長緩慢，子實體產量極少，但市場需求在不斷增大，野生牛樟芝市場價格一直居高不下。鑒于牛樟樹資源的稀缺和牛樟芝的神奇功效，科學家將牛樟芝的獲取聚焦到了人工培養上，包括椴木培養、固態培養和液體發酵。椴木培養利用樟芝原有宿主牛樟樹或其他椴木(樹齡都在80年以上的椴木)為培養基栽培牛樟芝，培養時間大約2年。固態培養雖然能夠培養出和野生牛樟芝類似的子實體，但其生產周期較長(3個月)、成本也比較高，同時，無論椴木培養還是固體培養基中也需要牛樟木，進而導致牛樟樹盜閥，濫采。牛樟芝的液體發酵技術已經有了較多的研究，相比與椴木和固態培養，液體發酵周期較短(少于20天)，可大量生產出牛樟芝菌絲體，利于工業化、規模化生產。但總體上菌絲體的產量還處于較低水平，同時，生物活性物質的含量不但低而且同野生子實體中的物質活性有較大差異，有文獻報道在牛樟芝的液體發酵中添加牛樟樹的莖、葉、果實等部位的干粉或其提取物均能有效促進菌絲體的生產和提高重要代謝產物的含量和活性，但該方法在工藝和生產成本等方面受到了極大的限制，同時對牛樟樹也具有巨大的破壞作用。
因此，如何在保護牛樟樹這一珍貴資源的前提下，開發一種具有牛樟樹特定作用、低成本，同時對牛樟芝的菌絲體生產、活性產物積累具有明顯促進作用的培養方法是亟待解決的關鍵問題。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種促進牛樟芝菌絲體生長和活性產物合成的方法。
本發明所采取的技術方案是：
一種促進牛樟芝菌絲體生長和活性產物合成的方法，是以牛樟樹的幼莖和/或幼葉細胞的愈傷組織作為接種物進行液體懸浮培養，所獲液體懸浮培養物和/或經處理后得到的液體懸浮培養物干粉添加至牛樟芝的液態發酵液中，繼續培養至發酵結束，從而大大提高牛樟芝的菌絲體生物量和生物活性物質的產量。
優選的，愈傷組織選自牛樟樹幼莖和/或幼葉誘導的在固體培養基上呈淡白色、生長狀態良好、質地疏松的愈傷組織。本發明優選愈傷組織以30-50g/l的接種量接種到ms培養基(ph為6.0-6.5)中進行培養16-24d，得到培養液(包括其中的有效成分)，即為本發明的液體懸浮培養物。
優選的，液體懸浮培養物按照30-350ml/l的添加量(干物質為0.5-30g/l)添加到牛樟芝的液態發酵液中。
優選的，液體懸浮培養物按照60ml/l的添加量(干物質為0.5-30g/l)添加到牛樟芝的液態發酵液中，可獲得較大的菌絲體生物量以及多糖含量和三萜含量。
優選的，液體懸浮培養物經過濃縮、過濾、干燥、粉碎得到液體懸浮培養物干粉。
優選的，液體懸浮培養物干粉按照0.5-30g/l的添加量添加到牛樟芝的液態發酵液中。
優選的，液體懸浮培養物按照20g/l的添加量添加到牛樟芝的液態發酵液中，可獲得較大的菌絲體生物量。
優選的，液體懸浮培養物按照10g/l的添加量添加到牛樟芝的液態發酵液中，可獲得較大的多糖含量和三萜含量。
優選的，所獲液體懸浮培養物和/或其干粉添加到牛樟芝的液態發酵液中的時間為牛樟芝液態發酵12天以內(12天不包括種子發酵時間)。一般來說，為了節約成本，在種子發酵時無需加入添加物，再擴大培養時添加本發明的添加物。
本發明通過實驗，發現液體懸浮培養物在牛樟芝液態發酵第2天添加，可獲得較大的菌絲體生物量；在牛樟芝液態發酵第8天添加，可獲得較大的多糖含量和三萜含量。液體懸浮培養物干粉在牛樟芝液態發酵第2天添加，可獲得較大的菌絲體生物量；在牛樟芝液態發酵第8天添加，可獲得較大的多糖含量和三萜含量。
一種牛樟芝液態發酵的添加物，所述添加物為牛樟樹的幼莖和/或幼葉細胞的液體懸浮培養物和/或其干粉。
優選的，牛樟樹幼莖和/或幼葉細胞以其愈傷組織為接種物進行液體懸浮培養得到液體懸浮培養物。
優選的，液體懸浮培養物經過濃縮、過濾、干燥、粉碎得到液體懸浮培養物干粉。
優選的，所述添加物為牛樟樹的幼莖細胞的液體懸浮培養物和/或其干粉。本發明研究發現牛樟樹的幼莖細胞的效果好于幼葉細胞的效果。
一種牛樟芝液態發酵用培養基，所述液態發酵培養基中添加有上述添加物。
牛樟樹幼莖和/或幼葉細胞的液體懸浮培養物和/或其干粉作為添加物在牛樟芝液態發酵中的應用。
優選的，牛樟樹幼莖和/或幼葉細胞在進行液體懸浮培養前，先接種到固體培養基上獲得愈傷組織，以愈傷組織為接種物進行液體懸浮培養。
優選的，愈傷組織為淡白色、生長狀態良好、質地疏松的愈傷組織。
優選的，液體懸浮培養物經過濃縮、過濾、干燥、粉碎得到液體懸浮培養物干粉。
如專利所使用術語，具有下述含義。
懸浮培養，指的是一種在受到不斷攪動或搖動的液體培養基里，培養單細胞及小細胞團的組織培養系統，是非貼壁依賴性細胞的一種培養方式。某些貼壁依賴性細胞經過適應和選擇也可用此方法培養。增加懸浮培養規模需要相應增加體積。深度超過5mm，需要攪動培養基，超過10cm，還需要深層通入co2和空氣，以保證足夠的氣體交換。通過振蕩或轉動裝置使細胞始終處于分散懸浮于培養液內的培養方法。
一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉移到液體培養基中進行培養。在培養過程中不斷進行旋轉震蕩，一般可用100～120r/min的速度進行。由于液體培養基的旋轉和震蕩，使得愈傷組織上分裂的細胞不斷游離下來。在液體培養基中的培養物是混雜的，既有游離的單個細胞，也有較大的細胞團塊，還有接種物的死細胞殘渣。
愈傷組織(callus)原指植物體的局部受到創傷刺激后，在傷口表面新生的組織。它由活的薄壁細胞組成，可起源于植物體任何器官內各種組織的活細胞。其發生過程是：外植體中的活細胞經誘導，恢復其潛在的全能性，轉變為分生細胞，繼而其衍生的細胞分化為薄壁組織而形成愈傷組織。
本發明優選牛樟樹幼莖和/或幼葉誘導的愈傷組織，也即，本技術一開始僅需要少量的牛樟樹幼莖和/或幼葉樣本，繁殖得到大量的愈傷組織，而愈傷組織可以不斷接種培養，提供源源不斷的接種物。
液態發酵，是相對于固態發酵而言，液態發酵中干物質含量在10％以內。通常包括種子和進一步的發酵培養。
本發明的有益效果是：
本發明方法可以克服現有技術中需要較多牛樟樹資源的缺陷，僅需要少量的牛樟樹的幼莖和幼葉樣本，便可以進行組織培養，獲得大量的愈傷組織作為接種物。進一步液體懸浮培養，所獲液體懸浮培養物或經處理后得到的液體懸浮培養物干粉添加至牛樟芝的液態發酵液中，繼續培養至發酵結束。本發明方法可有效降低牛樟芝液體成本，并對牛樟樹資源的保護起到了積極作用。
本發明將牛樟樹的幼莖和幼葉細胞的愈傷組織接種到液體培養基中進行懸浮培養，所獲得的液體懸浮培養物或其干粉作為牛樟芝的液態發酵的添加物。所述添加物能夠促進牛樟芝產活性成分，可以實現細胞的快速增殖和代謝產物積累，該技術不受季節、環境、病蟲害影響，同時不占用耕地，生產周期較短、成本較低，且對已有的牛樟樹資源不構成危害。該技術的應用為牛樟芝高活性物質的液體發酵制備提供了有力的保證。
本發明可大幅提高牛樟芝的液體發酵水平，對菌絲體生長和活性產物的合成具有明顯的促進作用，差異極顯著。實施例1中添加莖細胞懸浮培養物，菌絲體干重(即菌絲體生物量)比對照組1提高了32％，比對照組2提高了26％；多糖含量比對照組1提高了58％，比對照組2提高了56％；三萜含量比對照組1提高了106％，比對照組2提高了98％。
本發明的技術可以與現有技術進行聯用，在現有技術(包括培養基和培養方法)的基礎上添加本發明的添加物，可以顯著提高活性物質的相關產量。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步闡述，實施例將幫助更好地理解本發明，但本發明并不僅僅局限于下述實施例。
實施例1
牛樟樹莖和葉細胞懸浮培養技術為本領域常用技術，首先誘導牛樟樹莖和葉產生愈傷組織，然后利用愈傷組織進行細胞懸浮培養，獲得液體懸浮培養物。本實施例中采用下述培養基。
牛樟樹幼莖和/或幼葉愈傷組織培養基：ms基本培養基，卡拉膠7g/l，ph為6.2。
牛樟樹細胞懸浮培養基：ms基本培養基，ph為6.2。
具體方法包括下列步驟：
牛樟樹幼莖和/或幼葉愈傷組織培養：取牛樟樹組培無菌瓶苗的幼莖和幼葉，接種于牛樟樹幼莖和幼葉愈傷組織固體培養基中，溫度25℃，黑暗培養30d，得牛樟樹幼莖和幼葉愈傷組織。
牛樟樹莖和/或幼葉細胞懸浮培養：選取愈傷組織固體培養基上淡白色、生長狀態良好、質地疏松的牛樟樹幼莖和/或幼葉誘導而來的愈傷組織，以40g/l鮮重的接種量裝入盛有80ml牛樟樹細胞懸浮培養基的250ml三角瓶中，120r/min，遮光培養20d，得到液體懸浮培養物(包括培養液及其中的有效成分)。
本發明將上述得到的液體懸浮培養物作為牛樟芝的液態發酵的添加物。牛樟芝的液態發酵技術為本領域常用技術。本實施例中采用下述培養基。
牛樟芝斜面培養基：綜合pda培養基。
牛樟芝種子培養基：pda液體培養基，自然ph。
牛樟芝發酵培養基：葡萄糖35g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，mgso4·7h2o2g/l，kh2po43g/l，vb10.1g/l，自然ph。
牛樟芝的液態發酵方法具體包括下列步驟：
牛樟芝種子斜面：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，接種于pda斜面培養基上，28℃培養20天。
牛樟芝種子液體發酵：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，取1cm2的小方塊接種到液體種子培養基中。種子培養基搖瓶(250ml)每瓶裝液量80ml，接種后于28℃、110rpm條件下培養10天。
牛樟芝搖瓶液體發酵：將生長好的一級種子液混合，均勻接種到500ml搖瓶，每瓶裝液量150ml，接種量為10ml，接種后于28℃、110rpm條件下培養15天。
發酵接種前，分別在牛樟芝發酵培養基中添加牛樟樹莖(組1)和葉(組2)的細胞懸浮液體培養物20ml以及兩者混合液體培養物(組3)各10ml，對照組1為添加20ml空白牛樟芝液體發酵培養液，對照組2為添加20ml空白細胞懸浮培養液。
發酵結束后收集菌絲體，測定干重以及菌絲體中多糖和三萜含量。結果顯示：所獲牛樟芝菌絲體生物量、多糖和三萜含量均比對照組1和2有提高，添加莖細胞懸浮培養物的提高幅度較大。其中添加莖細胞懸浮培養物，菌絲體干重(即菌絲體生物量)比對照組1提高了32％，比對照組2提高了26％；多糖含量比對照組1提高了58％，比對照組2提高了56％；三萜含量比對照組1提高了106％，比對照組2提高了98％。
實施例2
牛樟芝的培養基與培養方法同實施例1。
將實施例1中的牛樟樹莖和葉細胞懸浮液體培養物經過濾、烘干、粉碎后獲得干粉。
在牛樟芝發酵接種前，分別在培養基中添加牛樟樹莖和葉的培養物干粉5g/l或兩者干粉混合物各2.5g/l，對照組為不添加任何其他物質。
發酵結束后收集菌絲體，測定干重以及菌絲體中多糖和三萜含量。結果顯示：所獲牛樟芝菌絲體生物量、多糖和三萜含量均比對照組有提高。其中添加莖細胞懸浮培養物的提高幅度較大，菌絲體干重比對照組提高了47％；多糖含量比對照組提高了72％；三萜含量比對照組提高了132％。
實施例3
牛樟芝的培養基與培養方法同實施例1。
將實施例1中的牛樟樹莖細胞懸浮液體培養物經過濾、烘干、粉碎后獲得干粉。
在牛樟芝發酵過程中，分別在發酵第2、4、6、8、10、12天往培養基中分別添加牛樟樹莖液體培養物20ml，對照組為不添加任何其他接種物的情況下獲得空白細胞懸浮液體培養基20ml；或空白液體培養基獲得的干粉5g/l。
發酵結束后收集菌絲體，測定干重以及菌絲體中多糖和三萜含量。結果顯示：所獲牛樟芝菌絲體生物量、多糖和三萜含量均比對照組均有提高。其中菌絲體干重在發酵第2天提高幅度最大，添加液體培養物比對照組提高了33％，添加干粉提高了45％。而多糖含量和三萜含量均在發酵第8天添加時的提高幅度最大，多糖含量比對照組提高了67％，三萜含量比對照組提高了144％。
實施例4
牛樟芝的培養基與培養方法同實施例1。
在牛樟芝發酵接種前，分別在培養基中添加牛樟樹莖液體培養物5、10、20、40、60ml，對照組為添加相應體積的空白細胞懸浮培養液。
發酵結束后收集菌絲體，測定干重以及菌絲體中多糖和三萜含量。結果顯示：所獲牛樟芝菌絲體生物量、多糖和三萜含量均比對照組高。其中菌絲體生物量分別在液體培養物添加60ml時提高幅度最大，比對照組提高了36％。多糖和三萜含量均在添加液體培養物60ml提高幅度最大，其中多糖含量比對照組70％，三萜含量比對照組提高了109％。
實施例5
牛樟芝的培養基與培養方法同實施例1。
將實施例1中的牛樟樹莖細胞懸浮液體培養物經過濾、烘干、粉碎后獲得干粉。
在牛樟芝發酵接種前，分別在培養基中添加牛樟樹莖液體培養物干粉0.5、1、2、5、10、20g/l，對照組為不添加任何其他物質。
發酵結束后收集菌絲體，測定干重以及菌絲體中多糖和三萜含量。結果顯示：所獲牛樟芝菌絲體生物量、多糖和三萜含量均比對照組高。其中菌絲體生物量在干粉添加20g/l時提高幅度最大，比對照組提高了58％。多糖和三萜含量均在添加干粉10g/l時提高幅度最大，其中多糖含量比對照組提高了79％，三萜含量比對照組提高了159％。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。