本發明屬于食品致病菌檢測技術領域，具體涉及一種牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法。
背景技術：
食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌對人類健康造成極大危害，是食品安全的重大隱患。食源性疾病并不隨經濟發展和技術進步而減少或消失，世界范圍內食品安全惡性事件接連發生，食源性疾病未能受到有效控制，食源性疾病發生率居高不下，食品安全形勢嚴峻。盡管政府監管部門不斷加大對食品安全的監管力度，對食品安全研究領域科研投入逐年加大，同時食品企業也不斷提高生產過程中食品安全意識，引進了haccp等先進的管理體系來確保食品安全，但是食源性致病菌污染食品進而導致食源性疾病暴發日益頻繁。目前對致病菌污染食品途徑控制當中，還無法找到一種完全有效杜絕致病菌污染的方式，開發出快速靈敏實用性強的致病菌檢測方法就成為確保食品安全的一個重要保障。
現階段常用的快速檢測方法雖然得到廣泛應用，常規pcr和免疫學檢測方法,通常面臨的問題是檢測方法靈敏度不夠高，一般食品樣品經過選擇性增菌處理后，待檢細菌濃度要達到104-105cfu/ml才能得到比較準確結果，當食品樣品中存在防腐劑，天然抗菌，抑菌成分時，往往待檢致病菌濃度達不到檢測限，導致出現假陽性結果。
綜上，現有技術存在的缺點是，檢測方法靈敏度不夠高，容易出現假陰性結果。
技術實現要素：
本發明提供的一種牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，解決了現有技術的常規pcr和免疫學檢測方法靈敏度不夠高，容易出現假陰性結果的問題。
本發明的目的是提供一種牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：
s1，收集待測樣品
s2，制備環糊精處理樣品
向待測牡蠣樣品中加無菌生理鹽水，均質處理，加入環糊精，并使溶液中環糊精最終濃度為10g/100ml，均質處理，低速離心去除大顆粒物質，所得上清液高速離心，將沉淀物溶于0.01m醋酸生理鹽水緩沖液，得到環糊精處理樣品；
s3，制備膨潤土包被活性炭
活性炭用去離子清洗，瀝干備用；向膨潤土中加入去離子水，膨潤土與去離子水的比例為1g：50ml，震蕩1min，700rpm離心1min，棄沉淀，將上層溶液轉至干凈的容器中，加入瀝干的活性炭，上層溶液與瀝干的活性炭之間的比為例為4ml：1g，37℃搖床過夜，隨后55℃烘干，得到膨潤土包被活性炭；
s4，制備膨潤土包被活性炭處理樣品
用0.85％生理鹽水清洗膨潤土包被活性炭，將環糊精處理樣品與清洗好的膨潤土包被活性炭混合，室溫震蕩；將震蕩后的混合物轉移至裝有玻璃棉的容器內，用醋酸生理鹽水緩沖液清洗并收集洗脫液；洗脫液離心，棄去上清液；將沉淀懸浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鮭魚精dna溶液和去離子水；沸水浴，得到的細胞裂解物冰上冷卻至室溫，離心，加入等量體積4℃預冷的無水乙醇，離心，棄去上清液，保留沉淀的dna，加入無菌去離子水溶解沉淀的dna，得到dna模板，備用；
s5，pcr檢測
pcr檢測使用的引物序列為：
inlb1：5’-aatcactttctttggagcataatggtataagtg-3’
inlb2：5’-gttccatcaacatcataacttactgtgtaaacc-3’
如果獲得的pcr檢測產物片段為279bp，則結果為陽性。
優選的，上述牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，每升0.01m醋酸生理鹽水緩沖液中溶質為0.01mol的乙酸和0.01mol的乙酸鈉，溶劑為0.85％nacl溶液，用0.1m鹽酸調節ph為5.0。
優選的，上述牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s2的具體步驟為：取待測牡蠣樣品中加入無菌0.85％生理鹽水，待測牡蠣樣品與無菌0.85％生理鹽水的比例為1g：3ml，均質處理，加入環糊精，并使溶液中環糊精最終濃度為10g/100ml，繼續均質2min，低速離心1000rpm、5min，去除大顆粒物質，所得上清液高速離心10000rpm、10min，將沉淀物溶于0.01m醋酸生理鹽水緩沖液，得到環糊精處理樣品。
優選的，上述牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s3中，所述活性炭為200目的粉末。
優選的，上述牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s3中，每120ml上層溶液中含有1.52g的膨潤土。
優選的，上述牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s4中，膨潤土包被活性炭與環糊精處理樣品的比例為4.6g：30ml。
優選的，上述牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s4中，所述將沉淀懸浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鮭魚精dna溶液和去離子水中，牛血清白蛋白溶液、鮭魚精dna溶液和去離子水的體積比例為1:1:3。
優選的，上述牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法中，s5中，pcr采用50μlpcr反應體系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物inlb1，0.5μl引物inlb2，0.25μltaqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl；
pcr反應條件為：94℃，4min預變性；94℃，20s變性；60℃，20s退火；72℃，50s延伸，35個循環；72℃，10min終延伸；4℃保存。
與現有技術相比，一種牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，具有以下有益效果：
(1)本發明的方法是一種從牡蠣中靈敏快速實用性強無需前增菌的pcr檢測方法，大大縮短目前常規單核細胞增生李斯特氏菌檢測及快速檢測方法的檢測時間(新建立的檢測方法對樣品的檢測時間為4小時)，且檢測限僅為10cfu/25g，檢測靈敏度高，不容易出現假陰性結果，可以確保食品從農場到餐桌流通過程中的食品安全實時檢測，進而更好地確保消費者健康。
(2)由于食品中含有大量的pcr反應抑制因子，比如脂肪，蛋白質，酶，抗生素，有機和無機化學物質，多糖類物質等，這些抑制因子極大地影響了pcr方法對食品中致病菌檢測的應用。目前，對于克服pcr反應抑制因子的方法是通過檢測前12-24小時增菌的手段，提高檢測的靈敏度，但同時也延長了檢測時間。
本發明的目的是建立有效的樣品處理方法提高致病菌從食品中的回收率，消除pcr反應抑制因子。β-環糊精(β-cyclodextrin)是一種環狀多糖化合物，其中七個葡萄糖單體與一個特定體積的中空內部形成一個截短的錐形結構。它的疏水性空洞內可嵌入各種有機化合物，形成包接復合物，并改變被包絡物的物理和化學性質。活性炭具有極強的吸附能力，這種吸附能力會受到碳表面化學結構的強烈影響。根據前期實驗工作證實，定量的膨潤土結合活性炭，并于β-環糊精結合使用，可以有效的將致病菌從食品中分離，并且能夠有效的去除pcr反應抑制因子，另外在樣品處理過程中添加定量鮭魚精dna可以進一步去除pcr反應抑制因子，提高檢測靈敏度，所以新建立的檢測方法對樣品的檢測時間僅需要4小時。經申請人實驗證明，如果不采用膨潤土、活性炭、β-環糊精、鮭魚精dna則pcr檢測結果難以辨別，甚至無法得到pcr擴增結果。
從而，本發明針對單核細胞增生李斯特氏菌為檢測目標，建立一種從牡蠣中靈敏快速實用性強無需前增菌的pcr檢測方法。
附圖說明
圖1是陽性和陰性檢測結果電泳圖；
其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為陽性檢測結果，2號泳道為陰性檢測結果。
具體實施方式
下面結合具體實例對本發明進行詳細說明，但不應理解為本發明的限制。下面實例中未注明具體條件的實驗方法，均按照本領域的常規方法和條件進行。
實施例1
一種牡蠣中單核細胞增生李斯特氏菌的快速檢測方法，包括以下步驟：
s1，收集待測樣品
本實施例1收集的待測樣品為人工污染樣品，人工污染樣品按以下方法制備：取25g牡蠣樣品人工污染1ml單核細胞增生李斯特氏菌菌懸液(濃度范圍分別為100cfu/ml、101cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml)，人工污染的樣品放入4℃冰箱中保存過夜，確保致病菌有效的吸附在樣品上，得到人工污染樣品，檢測開始前要對樣品中的待檢致病菌濃度進行實際測試，測試方法參照現行國家食品中各種致病菌檢測方法進行。
s2，制備環糊精處理樣品
取25g人工污染樣品中加入75ml無菌0.85％生理鹽水，利用均質機進行均質處理，加入環糊精溶液，并使溶液中環糊精最終濃度為10g/100ml，繼續均質處理2min，低速離心1000rpm、5min，去除大顆粒物質，所得上清液高速離心10000rpm、10min，將沉淀物溶于30ml0.01m醋酸生理鹽水緩沖液，得到環糊精處理樣品。
其中，每升0.01m醋酸生理鹽水緩沖液中溶質為0.01mol的乙酸和0.01mol的乙酸鈉，溶劑為0.85％nacl溶液，用0.1m鹽酸調節ph為5.0。
s3，制備膨潤土包被活性炭
將200目的活性炭用去離子清洗3次，瀝干備用。向4g膨潤土中加入200ml去離子水，震蕩1min，700rpm離心1min，棄沉淀，將120ml含有1.52g的膨潤土的上層溶液轉至1升的燒杯，加入30g瀝干的活性炭(濕重)，燒杯放在旋轉搖床中150rpm、37℃搖床過夜(≥12h)，隨后將燒杯中的溶液放置在55℃烘箱中烘干，直至膨潤土包被的活性炭變干(水分含量≤1％)，得到膨潤土包被活性炭。
需要說明的是，膨潤土需要先進行清洗，除掉一些雜質，才能使用，我們實驗證實了離心后的膨潤土溶液中膨潤土的含量是1.52g/120ml，所以不能直接將1.52g的膨潤土加入到120ml水中，否則會影響檢測結果。
s4，制備膨潤土包被活性炭處理樣品
取4.6g膨潤土包被活性炭加入到250ml燒杯中，用20ml0.85％生理鹽水清洗2次，將30ml環糊精處理樣品與清洗好的膨潤土包被活性炭混合，混合物在室溫下160rpm旋轉震蕩15min；取0.2g無菌玻璃棉放至50ml無菌塑料注射器底部，將震蕩后的混合物轉移至裝有玻璃棉的注射器內，以無菌離心管為收集容器，用醋酸生理鹽水緩沖液清洗直至在無菌離心管中收集到30ml洗脫液。30ml洗脫液經10000rpm離心10min，棄去上清液保留沉淀。沉淀懸浮在0.5ml含有100μl5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入100μl0.05mg/ml鮭魚精dna溶液和300μl去離子水。
將離心管放入沸水中，沸水浴熱裂解細胞10min，將得到的細胞裂解物冰上冷卻至室溫，12000rpm離心5min，將上清液轉移至干凈離心管內，加入等量體積4℃預冷的無水乙醇，以沉淀dna，離心管再次12000離心15min，棄去上清液，保留沉淀，加入100μl無菌去離子水溶解沉淀的dna，dna樣品分裝，每份10μl，得到dna模板，備用。
s5，pcr檢測
針對單核細胞增生李斯特氏菌毒力基因(inlb)設計特異引物序列，優化反應條件。所述引物序列為：
inlb1：5’-aatcactttctttggagcataatggtataagtg-3’
inlb2：5’-gttccatcaacatcataacttactgtgtaaacc-3’
50μlpcr反應體系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物inlb1(40μmol/l)，0.5μl引物inlb2(40μmol/l)，0.25μl(5u/μl)taqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl。
pcr反應條件：94℃，4min預變性；94℃，20s變性；60℃，20s退火；72℃，50s延伸，35個循環；72℃，10min終延伸；4℃保存。
如果獲得的pcr檢測產物片段為279bp，則結果為陽性，陽性和陰性檢測結果電泳圖如圖1所示。其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為陽性檢測結果，2號泳道為陰性檢測結果。
需要說明的是，實施例1中使用的環糊精是β-環糊精。
我們對市場上出售的牡蠣進行實際測試，提取單核細胞增生李斯特氏菌，其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌的dna作為模版，利用本檢測方法pcr反應體系來驗證檢測方法的特異性。
實驗組s1中收集的是市售牡蠣，其余步驟均與實施例1的方法相同。以已經公開發表的單核細胞增生李斯特氏菌檢測引物特異性(prfa:cccaagtagcaggacatgctaa；ggtatcacaaagctcacgag)作為對照，其余操作同實驗組。同時以現行國家食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測標準方法作為對比，來驗證新建立的pcr檢測方法的實用性，結果見表1。
表1結果表明，實施例1采用的引物序列具有較好的特異性，只對單核細胞增生李斯特氏菌呈陽性檢測結果，而對其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌呈陰性檢測結果。而另外一種prfa引物對于部分單核細胞增生李斯特氏菌呈陰性結果，部分其他李斯特氏菌檢測呈陽性結果，表明該引物序列的特異性并不是很理想，存在假陰性檢測結果的缺陷。現行國家食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測標準方法與實施例1的結果相同，故表1中僅以inlb特異性結果來表征。
表1檢測方法的特異性
注：表1中“+”表示陽性結果，“—”表示陰性結果。
將不同濃度的單核細胞增生李斯特氏菌人工污染到牡蠣中，利用實施例1的檢測方法進行檢測，確定實施例1的檢測靈敏度，結果見表2。由表2可知，實施例1的檢測方法的檢測靈敏度為10cfu/25g，且穩定性良好。
表2檢測方法的靈敏度
注：表1中“+”表示陽性結果，“—”表示陰性結果。
采集市售新鮮牡蠣樣品200份，分別采用快速檢測方法和現行國家檢測標準進行檢測對比，用來驗證該快速檢測方法的實用性，結果見表3。由表3可知，實施例1的方法與現有國家標準方法的檢出率、符合率和活體菌檢測率均相同，但是實施例1的方法檢測時間明顯縮短，僅為4小時。
表3實際樣品測試結果
需要說明的是，本發明權利要求書中涉及數值范圍時，應理解為每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用，由于采用的步驟方法與實施例相同，為了防止贅述，本發明的描述了優選的實施例1，盡管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明范圍的所有變更和修改。
顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。