一種鑒別大黃魚遺傳性別的分子標記及其應用的制作方法

本發明涉及水產生物技術領域中的魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術，具體涉及一種鑒別大黃魚遺傳性別的分子標記及其應用。

背景技術：

在生命科學研究領域，性別研究一直是一個熱點命題，吸引著眾多研究者的關注。魚類在動物進化中處于承前啟后的地位，且物種數量豐富。同大多數脊椎動物類似，不少魚類也是雌雄異體，具有性別二態性，即在形態和生理上表現出顯著的雌雄兩性差異。而且，一些魚類物種的個體生長等重要經濟性狀及經濟價值與性別密切相關。因此，開發這些魚類的單性育種與養殖技術在魚類養殖產業上具有重大的意義。許多魚類盡管在生長上存在性別二態性，但在外部形態上雌雄魚卻沒有顯著差異，尤其是在性腺尚未發育成熟時，其性別往往難以從外部形態上區分；甚至有一些魚類存在天然的性反轉現象，在不同的環境或者通過人工誘導可以改變其生理性別，但性別改變前后沒有形態上的差異，無法通過外部形態識別其遺傳性別。這些問題的存在給單性育種、養殖及相關的遺傳學基礎研究帶來很大的困擾，尤其是性別決定分子機制研究。因此，針對這些魚類物種開發可以準確鑒定其遺傳性別的分子標記，不僅對這些魚類遺傳學相關的研究，而且對開展單性育種與養殖從而提高魚產量、增加水產養殖收益都有著非常重要的意義。

大黃魚(larimichthyscrocea)隸屬脊索動物門、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬，分布于東亞沿海，兼具食用和藥用價值。大黃魚具有顯著的雌雄生長二態性，同時期的大黃魚雌魚生長速度顯著快于雄魚，且達到成熟時的雌魚個體較雄魚個體大，開發大黃魚單性育種及單性養殖技術具有重要的產業意義。但在性腺發育成熟之前，很難從外部形態上加以區分雌魚和雄魚，胚胎和幼體階段雌雄魚形態上幾乎沒有區別；據已有的研究表明，大黃魚不存在異形性染色體，也無法從細胞學角度鑒定其遺傳性別；這給其單性育種技術的開發帶來了很大困難。因此，開發一種可以準確鑒別其遺傳性別的分子標記用于大黃魚性別控制育種具有極大的生產應用價值。

隨著分子生物學技術的發展，目前已有多種類型的dna分子標記技術，其中主要包括：(1)限制性片段長度多態性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflp)；(2)隨機擴增多態性dna(randomamplificationpolymorphismdna，rapd)；(3)擴增片段長度多態性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，aflp)；(4)微衛星標記(microsatellite)，又稱為短串聯重復序列(shorttandemrepeats，strs)或簡單重復序列(simplesequencerepeat，ssr)；(5)單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，snp)。利用上述dna分子標記技術，已經有許多物種的性別特異的分子標記被開發出來，但不同物種其基因組dna序列結構不同，沒有一個物種的性別特異分子標記可以被用于對其他物種的遺傳性別進行鑒定，只能針對不同物種分別進行開發。可以識別與鑒定(鑒別)大黃魚遺傳性別的分子標記迄今為止國內外都還沒有見到報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種鑒別大黃魚遺傳性別的分子標記。

為實現上述目的，本發明提供一種大黃魚遺傳性別相關的分子標記，其特征在于，所述分子標記表現為seeidno:1所示核苷酸序列的插入/缺失長度多態性。

進一步，具有seeidno:1所示核苷酸序列的個體，表現為雌性大黃魚；缺失seqidno:1所示核苷酸序列的個體，表現為雄性大黃魚。

進一步，所述引物對具有seqidno:2-3或seqidno:4-5所示的核苷酸序列。

進一步，利用所述引物對seqidno:2-3對待檢測大黃魚基因組dna進行pcr擴增，并檢測擴增片段的長度，當所述擴增片段為112bp時，所述待測大黃魚具有seqidno:1所示核苷酸序列的插入，表現為雄性大黃魚；當沒有出現所述擴增片段時，所述待測大黃魚具有seqidno:1所示核苷酸序列的缺失，表現為雌性大黃魚；或

利用所述引物對seqidno:4-5對待檢測大黃魚基因組dna進行pcr擴增，并檢測擴增片段的長度，當所述擴增片段有兩條，分別為229bp和214bp時，所述待測大黃魚具有seqidno:1所示核苷酸序列的插入，表現為雄性大黃魚；當所述擴增片段為214bp時，所述待測大黃魚具有seqidno:1所示核苷酸序列的缺失，表現為雌性大黃魚。

本發明還提供一種用于檢測所述分子標記的試劑盒，其特征在于，包括所述的引物對。

所述分子標記，所述引物對，或所述試劑盒，在大黃魚育種中的用途。

本發明還提供一種鑒別大黃魚性別的方法，其特征在于，對待測大黃魚進行所述分子標記的檢測，以便確定所述待測大黃魚的性別。

進一步，所述方法包括：

利用所述引物對，所述試劑盒，對待測大黃魚基因組dna進行pcr擴增；

檢測擴增片段的長度，以及

基于所述擴展片段的長度，確定所述待測大黃魚的性別，

其中，當所述擴增片段為112bp，或者229bp和214bp時，所述待測大黃魚具有seqidno:1所示核苷酸序列的插入，表現為雄性大黃魚；當沒有出現所述擴增片段或擴增片段為214bp時，所述待測大黃魚具有seqidno:1所示核苷酸序列的缺失，表現為雌性大黃魚。

進一步，利用凝膠電泳,優選瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測所述擴增片段的長度。

本發明還提供一種大黃魚輔助育種方法，其特征在于，所述方法包括：通過所述方法，檢測所述分子標記，以便確定待測大黃魚的性別。

本發明的申請人比較了一處大黃魚雌雄魚基因組差異的序列(見圖1)，經過分析發現:seqidno:1為與大黃魚性別相關的分子標記。所述分子標記核苷酸序列為：

5'aatgagtttcactca3'(15bp)seqidno:1

本發明所述引物對序列如下所示：

a.lyc-ms引物

lyc-ms-f:5'ggctctgtgaggcgtctt3'seqidno:2

lyc-ms-r:5'cttacagttatctgcaatttgtatg3'seqidno:3

b.lyc-mfs引物

lyc-mfs-f:5'tggctctgtgaggcgtct3'seqidno:4

lyc-mfs-r:5'atacaatgatgacatcaatcctgat3'seqidno:5

采用本發明的分子標記進行黃魚遺傳性別的鑒別，與現有的鑒別大黃魚遺傳性別的方法相比，具有明顯的優勢：只需剪取大黃魚的部分組織或提取部分血液用來提取基因組dna，進而從最小程度上減少對魚體的傷害。然后用所提供的引物做pcr，結合電泳檢測，即可快速、準確地鑒定不同生長階段的大黃魚不同個體的遺傳性別。

本發明具有如下優點：

1、本發明提供的大黃魚遺傳性別相關的分子標記不受大黃魚生長階段的限制，可用于大黃魚的早期選育，節省時間，同時可顯著促進大黃魚的育種進程。

2、檢測大黃魚如seqidno:1所示的大黃魚性別相關的分子標記的方法準確可靠，操作方便，成本低廉。

3、大黃魚如seqidno:1所示的大黃魚性別相關的分子標記的檢出，為大黃魚性別的輔助選擇提供了科學依據。

附圖說明

圖1為本發明公開的部分大黃魚雌雄魚全基因組重測序序列比對圖。

圖2為本發明用于驗證一處大黃魚雌雄魚基因組差異序列設計的lyc-mfs引物序列圖。

圖3為本發明采用lyc-mfs引物驗證一處大黃魚雌雄魚基因組差異序列得到的電泳圖。

圖4為本發明公開已經驗證的一處大黃魚雌雄魚基因組差異的序列圖。

圖5為本發明根據公開的一處大黃魚雌雄魚基因組差異的序列設計的lyc-ms引物序列圖。

圖6為實施例采用lyc-ms引物進行pcr擴增，鑒定大黃魚遺傳性別的電泳圖。

圖7為實施例采用lyc-mfs引物進行pcr擴增，鑒定大黃魚遺傳性別的電泳圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。

實施例1：大黃魚性別特異分子標記

大黃魚是二倍體生物且為xx/xy型性別決定系統，雌性為xx，雄性為xy。通過對6組雌雄大黃魚全基因組重測序數據進行比對分析，結果顯示來自雄魚的序列中存在15bp的缺失，如圖1。鑒于雄魚x染色體的序列同于雌魚兩條x染色體的序列，且該片段只在雄魚中缺失，雌魚不缺失，推測該缺失片段可能存在于雄魚y染色體上。進一步對6組數據中含有15bp片段的讀長進行統計分析，統計結果見表1。

表1對大黃魚雌雄魚全基因組重測序序列中存在15bp缺失的讀長的統計表

從表1可以看出，只有在雄性測序序列中存在著15bp的缺失。

為此，發明人根據其兩端的序列設計了lyc-mfs引物(圖2)，以大黃魚的基因組dna進行pcr擴增，擴增結果如圖3顯示。從圖3可以看出，在雄性個體中擴增出兩個片段，而雌性個體中只有一個片段。

為進一步驗證差異序列的準確性，將pcr產物送到華大基因進行sanger測序，并對測序的結果進行比對分析，部分序列比對結果如圖4。圖中呈現了雌性(♀)的x染色體序列(兩條x染色體序列相同)和雄性(♂)的一條x染色體序列及一條y染色體序列的比對。從圖4中可以看出，這15bp片段只在雄性個體中缺少，即在y染色體上缺失，由此說明該15bp的插入缺失片段是大黃魚遺傳性別的分子標記。

實施例2、大黃魚遺傳性別的識別與鑒定

剪取待測大黃魚的部分鰭條，放入95％的酒精溶液中，-20℃保存，相對應的個體通過解剖及組織學觀察確認其性別并進行記錄。利用dna提取試劑盒提取基因組dna，所得的基因組dna稀釋到30ng/μl左右作為模板備用；

申請人設計如下兩對引物(其中lyc-mfs引物已經用于上述分子標記的驗證)：

a.lyc-ms引物

lyc-ms-f:5'ggctctgtgaggcgtctt3'seqidno:2

lyc-ms-r:5'cttacagttatctgcaatttgtatg3'seqidno:3

b.lyc-mfs引物

lyc-mfs-f:5'tggctctgtgaggcgtct3'seqidno:4

lyc-mfs-r:5'atacaatgatgacatcaatcctgat3'seqidno:5

其中，lyc-ms的下游引物跨越該差異的序列，lyc-mfs的上下游引物分別在該差異的序列的兩邊。請參閱圖2和圖5。引物合成廠家為上海華大基因科技有限公司。

pcr反應體系：反應總體積為10μl，具體反應體系為：1μl10×pcrbuffer(含mg^2﹢)，0.8μl2.5mmdntps，1μl30ng/μldna(即模板)，10μm上下游引物各0.2～0.4μl，0.1μl5u/μltaqdna聚合酶，最后以ddh2o補齊。

pcr擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；最后72℃延伸10min。

瓊脂糖凝膠電泳檢測及結果分析：

選用lyc-ms引物(yc-ms-f/r，即seqidno:2-3)進行擴增的pcr產物，電泳檢測可采用1％的瓊脂糖凝膠，電壓120v，電流120a，電泳時間30min。結果圖6所示。其中泳道m為marker，其他泳道標記♀的表示檢測的是雌性大黃魚的dna，標記♂的表示檢測的是雄性大黃魚的dna。從圖6可以看出，該引物組合能夠從所有雄性個體的基因組dna中擴增出一條長約112bp的特異片段，而在所有雌性個體的基因組dna中沒有擴增片段。

選用lyc-mfs引物(lyc-mfs-f/r，即seqidno:4-5)進行擴增的pcr產物，電泳檢測可采用3％的瓊脂糖凝膠，電壓120v，電流120a，電泳時間60min。結果圖7所示。其中泳道m為marker，其他泳道標記雌的表示檢測的是雌性大黃魚的dna，標記雄的表示檢測的是雄性大黃魚的dna。從圖7可以看出，該引物組合能夠在所有雄性個體的基因組dna中擴增出兩條特異條帶，一條約229bp，一條約214bp，而在所有雌性個體的基因組dna中只可以擴增出一條約214bp的特異條帶。

應用兩對引物鑒別出的大黃魚的遺傳性別一致，且與解剖組織學觀察確認的性別一致。因此，采用本發明的引物均能準確的鑒別出大黃魚的性別。

盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。

sequencelisting

<110>集美大學

<120>一種鑒別大黃魚遺傳性別的分子標記及其應用

<130>jmdx-17011-cni

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