專利名稱:一種高通量測定轉植酸酶作物種子中植酸酶活性的方法
技術領域：
本發明涉及一種植酸酶活性的測定方法，尤其涉及一種快速、高通量的檢測轉植酸酶作物種子或添加有轉植酸酶作物種子的飼料中的植酸酶活性方法，屬于轉基因作物種子植酸酶活性的測定領域。
背景技術：
自1996至2010年，全球轉基因作物的種植面積在十五年間增長了 87倍，截止 2010年達到1.48億公頃，且每年都以10%以上的速度增長。迄今為止，共有59個國家批準種植或進口生物技術作物用于食物和飼料，其中包括四個國家批準了生物技術作物的本地化種植，全世界75%的人口居住在這59個國家。
截至目前所發展的轉基因植物中，轉基因玉米、大豆、棉花、油菜籽和馬鈴薯等都與飼料有關，用于動物的日糧中，其中占轉基因植物總種植面積80%以上的玉米和大豆在飼料中廣泛應用。世界上每年約有4000萬噸轉基因玉米用于飼喂動物。大豆和豆粕是飼料中的主要蛋白原料，因此用作飼料的轉基因大豆也有約7400多萬噸。加上棉籽粕和油菜籽粕，每年用于飼料的轉基因植物約為1. 2億噸以上。并且由于轉基因技術的快速發展，目前已有60 70%的飼料原料與轉基因植物相關，例如抗蟲的轉基因玉米和棉花，抗草甘膦的玉米和大豆等。正是由于轉基因作物發展迅猛，因此對轉基因植物及其產品的檢測方法也成為當今關注的技術。
玉米為中國的第一大糧食作物。2011年，中國玉米播種面積已達到4. 8億畝，位居世界第二。中國玉米總需求量的近80%作為飼料，且這個比例還在不斷增加。轉基因植酸酶玉米于2009年8月獲中國農業部頒發的《農業轉基因生物安全證書》，獲準進行生產應用，它是中國第一例批準生產應用的轉基因玉米。轉基因植酸酶玉米是以玉米種子作為生物反應器來生產植酸酶，通過生物技術和傳統育種方法相結合，將具有自主知識產權的植酸酶基因轉化到玉米中，培育出具有高活性植酸酶并穩定遺傳的轉基因玉米。植酸酶在動物的胃中釋放出來而降解飼料中的植酸磷，從而解決了飼料中植酸磷不能被動物吸收利用和導致環境污染等諸多問題。正是由于植酸酶所具有的安全、環保、高效、經濟等特點以及很好的社會生態環境效益，因此，在歐洲大部分國家已強制在飼料中使用植酸酶，目前中國市場上的單胃動物飼料中已經有90%添加了植酸酶，植酸酶的推廣應用可使植物性飼料中磷的利用率提高60%，糞便中磷的排出量減少40%，從而減少飼料中無機磷的添加量，降低飼料成本，減少高磷糞便造成的環境污染，還可降低植酸鹽的抗營養作用，因此對提高畜牧生產效益及降低其對環境的污染有重要意義。在轉基因植酸酶玉米誕生之前，在飼料中廣泛使用的植酸酶是通過微生物發酵生產的，而轉基因植酸酶玉米使用將更為經濟、方便、 有效。按照目前的飼料工業發展現狀，預計轉植酸酶基因玉米的市場需求量為每年5000萬噸(1000單位植酸酶/公斤玉米種子)，應用后可替代飼料中所添加的磷酸氫鈣80萬噸，減少動物糞便中磷的排除量100萬噸并降低飼料成本20億元。
目前，國際上最常用的酶活性單位定義是在植酸鈉濃度為5. Ommol/L、溫度37°C、PH值5. 50的條件，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μ mol無機磷即為一個植酸酶活性單位，國家標準GB/T 18634-2009也采用同樣的定義。植酸酶的活力測定原理是通過一些化學試劑與無機磷產生顏色反應，從而確定無機磷的釋放量。現有的測定轉植酸酶作物種子中植酸酶活性的方法有鉬-釩酸銨法、硫酸亞鐵-鉬藍法、Vc-鉬藍法和丙酮-磷鉬酸銨法。有研究發現，從靈敏度來說鉬-釩酸銨法最好，硫酸亞鐵-鉬藍法和Vc-鉬藍法次之，丙酮-磷鉬酸銨法最低(黃遵錫，章克昌，徐柔.植酸酶活性測定不同方法的比較研究.飼料工業， 1999,20(12) :20-22.)。但是，丙酮-磷鉬酸銨法的穩定性及抗干擾能力是最好的，常被用于測定飼料、發酵產物中的植酸酶活性(陳琛.植酸酶活性測定方法的研究進展.中國飼料，2010，2016-18.)。
公開號為CN 101914508A(發明名稱一種基于96孔板的植酸酶高通量篩選方法)的中國發明專利公開了一種高通量的測定植酸酶活性的方法，該方法在鉬-釩酸銨法測定植酸酶活性的基礎上建立微板法測定植酸酶活性的方法，雖然該方法一次能檢測較多數量的樣品，具有高通量檢測的優點，但是該檢測方法存在誤差較大、穩定性低，變異系數高等缺陷，有待改進。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有的檢測轉植酸酶作物植酸酶活性的方法所存在的缺陷，提供一種高通量測定轉植酸酶作物種子或添加有轉植酸酶作物種子的飼料中植酸酶活性的方法，該方法具有檢測效率高，誤差小，穩定性高，變異系數較小，重復性好等優點。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的
一種高通量測定轉植酸酶作物種子中植酸酶酶活性或添加有轉植酸酶作物種子的飼料中植酸酶酶活性的方法，包括以下步驟
(1)、以磷含量為橫坐標，OD415吸光值為縱坐標，建立標準曲線；
(2)、將待檢測樣品(轉植酸酶作物種子或添加有轉植酸酶作物種子的飼料)中的植酸酶浸提出來，得到轉植酸酶作物種子的植酸酶浸提液或添加有轉植酸酶作物種子的飼料的植酸酶浸提液；
(3)、將所提取得到的植酸酶浸提液在96孔微孔板中進行植酸酶的酶活性測定反應；
0)、酶活性測定反應結束后測定反應溶液的吸光值，對應標準曲線建立的直線回歸方程，計算出各個待測樣品中的磷濃度，再依據下列公式計算出待檢測樣品中的植酸酶活性
權利要求
1.一種高通量測定轉植酸酶作物種子或添加有轉植酸酶作物種子的飼料中植酸酶酶活的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)以磷含量為橫坐標，OD415吸光值為縱坐標，建立磷標準曲線； (2)將待檢測的轉植酸酶作物種子或添加有轉植酸酶作物種子的飼料樣品中的植酸酶浸提出來，得到植酸酶浸提液；(3)將植酸酶浸提液在96孔微孔板中進行植酸酶的酶活性測定反應； (4)酶活性測定反應結束后測定反應溶液的吸光值，對應標準曲線建立的直線回歸方程，計算出各個待測樣品中的磷濃度，再依據下列公式計算出待檢測樣品中的植酸酶活性
2.按照權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的轉植酸酶作物種子為轉植酸酶玉米、轉植酸酶大豆、轉植酸酶棉花種子、轉植酸酶油菜籽或轉植酸酶馬鈴薯。
3.按照權利要求
1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中按照以下方法建立標準曲線(a)、制備磷標準溶液；(b)、將磷標準溶液梯度稀釋；(C)、將梯度稀釋液各取40 μ 1，先加入250 mmol/L的pH值為5. 5的40 μ 1乙酸緩沖液，37° C預熱，再加入顯色液80 μ 1，37° C保溫，最后加入15 mmol/L的40 μ 1植酸鈉溶液， 室溫靜置后，波長415nm處測定樣品吸光值，繪制磷標準曲線。
4.按照權利要求
3所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述的梯度稀釋是將標準溶液分別稀釋成 1.5625 mmol/L,2. 5000 mmol/L,3. 1250 mmol/L、5.0000 mmol/L、6.2500 mmol/L的溶液。
5.按照權利要求
1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中按照以下步驟浸提得到植酸酶浸提液(a)將樣品研磨后過篩，混勻備用；優選的，所述的過篩是過0.45mm的標準篩； (b)樣品浸提向過篩后的樣品中加入植酸酶提取緩沖液，震蕩、離心，取上清；將上清再次離心，棄沉淀，取上清液，得到轉植酸酶作物種子的植酸酶浸提液或添加有轉植酸酶作物種子的飼料的植酸酶浸提液。
6.按照權利要求
5所述的方法，其特征在于將所得到的添加有轉植酸酶作物種子的飼料的植酸酶浸提液稀釋后加入到超濾離心管中離心，棄去下層液體，直到剩余的體積與稀釋前的添加有轉植酸酶作物種子的飼料的植酸酶浸提液的體積相等為止。
7.按照權利要求
6所述的方法，其特征在于所述的稀釋用PH值為5.5的乙酸緩沖液進行稀釋，其中，所加入的乙酸緩沖液與飼料樣品浸提液的體積比為10 1 ；所述的超濾離心管為截留量為3000道爾頓的超濾離心管。
8.按照權利要求
1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述酶活性測定反應包括以下步驟取40 μ 1待檢測的植酸酶浸提液，加入40 μ 1 ρΗ值為5. 5的250 mmol/L乙酸緩沖液， 37°C預熱后再加入40μ 1的15 mmol/L植酸鈉溶液，37°C保溫，最后加入顯色液80 μ 1，室溫靜置；其中，從加入植酸鈉底物開始，控制每個反應時間為30min。
9.按照權利要求
1所述的方法，其特征在于步驟(4)中酶活性測定反應完畢后，反應液如果出現渾濁，將反應液以4000r/min離心lOmin，吸出上清液再測定吸光值讀數；反應液如果沒有渾濁，直接將整塊96孔微孔板放入微孔板連續波長生物測讀儀內測定吸光值讀數。
10.按照權利要求
1所述的方法，其特征在于所述的測定吸光值讀數是在415nm處測定吸光值讀數。
專利摘要
本發明公開了一種高通量測定轉植酸酶作物種子中植酸酶活性的方法，該方法包括(1)以磷含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，建立磷標準曲線；(2)將待檢測樣品中的植酸酶浸提出來，得到植酸酶的浸提液；(3)將植酸酶的浸提液在96孔微孔板中進行植酸酶的酶活性測定反應；(4)測定反應溶液的吸光值，對應磷標準曲線建立的直線回歸方程計算出各個待測樣品中的磷濃度，再依據酶活計算公式計算出待檢測樣品的植酸酶活性。準確度和靈敏度試驗結果表明，本發明方法測定結果準確性好、誤差小、穩定性高、重復性好，變異系數也遠低于現有的微板法。本發明檢測方法具有高通量、檢測效率高、操作簡便、成本低、準確性高等優點。
文檔編號C12Q1/44GKCN102352406SQ201110326940
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月25日
發明者伍寧豐, 初曉宇, 姚斌, 楊文竹, 范云六, 陳茹梅 申請人:中國農業科學院生物技術研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan