專利名稱：：高比活植酸酶基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，更具體的，本發明涉及一種高比活的植酸酶及其應用。
背景技術：
：磷是動物機體必需礦物元素，雖然存在于動物性飼料中的磷大部分能被動物體吸收利用，但由于其價格昂貴，限制了在飼料中的使用。存在于植物性飼料中的磷大部分以植酸(即肌醇六磷酸)或植酸鹽的形式存在，而單胃動物體內缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸鹽水解的酶)，造成飼料中磷的利用率僅有1/3或更低，為了補充有效磷的不足，必須在飼料中添加無機磷酸鹽，這樣勢必造成磷源的浪費，導致磷的過量排泄。單胃動物飼料中通過添加植酸酶，可以提高飼料中植酸磷的利用率，減少磷的排出對環境的污染。植酸酶屬于磷酸單脂水解酶，是一種能降解植物性飼料中植酸及其鹽類的磷酸酯酶。植酸酶能將植酸分解為肌醇和磷酸，大部分植酸酶(85%)在胃部發揮作用，小部分在小腸前端起作用，小腸后端無植酸酶活動。植酸酶只作用于植酸，只有當飼料中存在足量的植酸時，添加植酸酶才有實際價值。隨著生物技術特別是采用DNA重組技術后，使植酸酶在生產中的大量應用成為可能。植物性植酸酶的最適pH值在4.8-6.0之間，在pH值小于3.0時，活性顯著下降，甚至失活。微生物植酸酶所耐受的pH值范圍比大多數植物性植酸酶要寬，一般pH值在2.5-6.0之間。絕大多數植酸酶發揮酶活性的最適溫度為45-55。C。并且，目前發現的各種植酸酶中，大多數植酸酶的酶活性還不夠理想，活性最高在8000U/ml(發酵效價)左右。因此，本領域需要進一步尋找新的適用pH值寬且活性高的植酸酶，以提髙動物對磷的吸收，有效地節省成本。
發明內容本發明的目的在于提供新型的高比活的植酸酶，該植酸酶具有很高的酶活性，并且具有很好的PH穩定性。在本發明的第一方面，提供一種分離的蛋白，該蛋白選自下組(a)具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDNO:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽同種功能(即具有分解植酸或植酸鹽的功能)的由(a)衍生的多肽。在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組編碼所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。在本發明的另一優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。在本發明的另一優選例中，該多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體；或它的基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發明的第五方面，提供所述的蛋白的用途，用于分解植酸或植酸鹽。在本發明的第六方面，提供一種制備所述的蛋白的方法，所述方法包括培養所述的宿主細胞，收集獲得所述的蛋白。在本發明的第七方面，提供一種組合物，所述組合物中含有有效量的所述的蛋白，以及食品學或飼料學上可接受的載體。在本發明的另一優選例中，所述的組合物中含有Mg2+、Ca2+、EDTA、或胃蛋白酶。在本發明的另一優選例中，所述的組合物中不含有Zn2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、或Fe3+。在本發明的第八方面，提供一種制備含有所述的蛋白的轉基因植物的方法，所述的方法包括步驟將所述的多核苷酸導入植物細胞中，培養所述的植物細胞，再生成植物。在本發明的另一優選例中，所述方法包括步驟(sl)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有所述的多核苷酸；(s2)將植物細胞或組織或器官與步驟(sl)中的農桿菌接觸，從而使所述的多核苷酸轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(s3)選擇出轉入所述的多核苷酸的植物細胞或組織或器官；以及(s4)將步驟(s3)中的植物細胞或組織或器官再生成植物。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。具體實施方式本發明人經過廣泛而深入的研究，發現一種新的高比活的植酸酶，本發明人將之命名為A卯A-M。試驗證實，該植酸酶具有很高的酶活性(在常溫(37。C)下酶活達到3.19X103U/mg);并且，該植酸酶在pH210之間均能維持酶活在80%以上，具有很好的pH穩定性。可見該植酸酶具有廣泛的應用前景。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的AppA-M蛋白或多肽"是指所述的AppA-M蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化AppA-M蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括AppA-M蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發明的天然AppA-M蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發明中，術語"AppA-M蛋白"指具有AppA-M蛋白活性的SEQIDNO:2序列的多肽。該術語還包括具有與AppA-M蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-50個，較佳地l-30個，更佳地l-20個，最佳地1-10個，還更佳如l-8個、l-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括AppA-M蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與AppA-M蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗AppA-M蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含AppA-M蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了AppA-M蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有AppA-M蛋白序列的至少約20個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約IOO個連續氨基酸。發明還提供AppA-M蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然AppA-M蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，"AppA-M蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。例如，這些保守性變異多肽可根據表l進行氨基酸替換而產生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發明還提供了編碼本發明AppA-M蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQIDNO:l所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發明中是指編碼具有SEQIDNO:2的蛋白質，但與SEQIDNO:l所示的編碼區序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指:(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.1。/。小牛血清/0.1。/。Fico11，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少10O個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼AppA-M蛋白的多聚核苷酸。本發明的AppA-M蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公幵的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或AppA-M蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。通過常規的重組DNA技術(Science，1984;224:1431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的AppA-M蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼AppA-M蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。本發明中，AppA-M蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含AppA-M蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發明的多核苷酸在一些宿主中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得轉基因的植物。獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。作為本發明的一種實施方式，可利用本發明的AppA-M蛋白的編碼基因來制備轉基因植物，獲得的轉基因植物表達AppA-M蛋白。將所述的轉基因植物作為動物的飼料成分，可以使飼料中具有穩定來源的，因而不需要額外添加植酸酶。此外，也可在動物體內導入AppA-M蛋白的編碼基因，從而動物自身可表達AppA-M蛋白，使AppA-M蛋白成為一種內源酶。這就省去了很多外源的添加工作。本發明還提供了一種組合物，它含有安全有效量的本發明的AppA-M蛋白以及食品學上或飼料學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乙酸、麥麩、玉米芯或它們的組合。組合物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的組合物可以被制成顆粒劑的形式，例如用玉米芯或麥麩以及其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。在喂食動物時，通常將含有安全有效量的AppA-M蛋白的組合物給予動物，在制備顆粒飼料時，通常調節飼料中AppA-M蛋白的酶活在0.005-50U/g;優選的為0.05-5U/g;更優選的為0.1-lU/g。當然，具體給予劑量還應考慮飼料的其它營養成分配方、動物的自體狀況等因素，這些都是本領域技術人員所熟知的。作為本發朋的一個實例，本發明提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸是通過從長年累積枯葉的樹林區域采集大量土壤標本或者動物的瘤胃中的標本，從中選取對植酸具有很強代謝能力的菌群，并且根據酵母的密碼子偏愛性進行了密碼子優化而獲得的。其序列如SEQIDNO:l所示，它包含的多核苷酸序列全長為1233個堿基，編碼全長為410個氨基酸的AppA-M蛋白(SEQIDNO:2)。該蛋白可添加到動物飼料或其它需要補充植酸酶以分解植酸或植酸鹽的物質中，用于分解植酸或植酸鹽。本發明的主要優點在于首次分離得到一種新的高比活的植酸酶，該植酸酶具有很高的活性(比活性為3.19X103U/mg)，在發酵罐水平，經甲醇誘導120h后表達量達到2.5mg/mL，植酸酶活性(發酵效價)達1.2Xl(^U/mL以上；該植酸酶在pH210之間均能維持酶活在80%以上，具有很好的pH穩定性；該植酸酶還具有非常好的抗胃蛋白酶水解能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力；因此可見，本發明的植酸酶具有廣泛的應用前景。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照以下文獻中公布的方法:CarlW.Dieffenbach和GabrielaS.Devkslereds.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。或按照制造廠商所建議的條件。實施例l:髙比活植黢瞜基因的克隆1.樣品的采集從長年累積枯葉的樹林區域采集大量土壤標本或者動物的瘤胃中的標本，這些地方由于具有大量植物性的植酸，因此可通過篩選獲得對植酸具有很強代謝能力的菌群，從而分離出具有高比活特性的植酸酶基因。2.采用兔培養方法從土壤樣品中分離群落水平總DNA稱取樣品2克，加入0.6g細玻璃珠(cKO.llmm)，4000轉/分振蕩2次。加入300u12%SDS+12%苯酚Tris緩沖液(pH8.0)溶液冰上1小時，加入等量苯酚Tris緩沖液，pH8.0(約700ml)，充分混勻，經4°C，13，000rpra離心5分鐘。上層溶液加入0.1倍體積的3MNaAcpH5.2，混勻后加入0.6倍體積異丙醇混勻。DNA沉淀溶于200nl1XTE(粗DNA)。稱100mg氯化銫置于一個新的1.5mlEpp.離心管中，加入lOOu1粗DNA輕輕混勻，室溫黑暗條件下靜置1-3小時。室溫，13,000rpm，離心20分鐘。上清液中加入400u1無菌去離子水和300U1異丙醇，室溫靜置30分鐘。室溫，13,000rpm,離心20分鐘。沉淀溶于100ullXTE禾卩40ul8M醋酸鉀(KAc)，室溫靜置15分鐘。4。C，13，000rpm離心15分鐘。上清液加入0.6倍體積異丙醇混勻。室溫靜置30分鐘。室溫，15,000rpm離心20分鐘。DNA沉淀溶于100nl1XTE。釆用Wizardspincolumnclean-叩分離試劑盒純化DNA樣品。純化DNA溶于總體積為lOOn1的lOmMTris-EDTA(pH8.O)緩沖液中。3.群落水平總DNA粘粒文庫的構建采用粘粒SuperCoslCosmidVectorKit(購自Stratagene公司)構建群落水平總DNA的粘粒文庫。采用0.006u/PgDNA的Sau3AI酶量大量酶切純化的群落水平總DNA，常規凍融法回收40kb左右的部分酶切片段，與載體SuperCosl/BamHl片段連接。按Stratagene公司提供的試劑盒說明書構建粘粒文庫。將群落水平總DNA片段與載體的連接產物用噬菌體包裝蛋白包裝后，轉入大腸桿菌JM109(ATCC)中。將轉染的大腸桿菌JM109涂布于四環素抗性LB固體培養基上，將長出的菌落分別點于四環素抗性和四環素加卡那霉素抗性的LB固體培養基上，在兩種抗性培養基上生長的轉化子為粘粒載體自連轉化，減去背景菌落數，根據經驗公式計算滴度(pfu/ml)為4Xl(f(大于106)，表明文庫構建符合要求。4.篩選植酸鈣水解活性轉化子將轉染細菌按每板103個菌落涂布于0.5%植酸銬固體培養基上，兩天后生長菌落，用無菌牙簽將具有透明水解圈的菌落點于含植酸鈣的固體培養基上，平均每板50個，培養后挑選出水解圈最大的幾個菌落，常規方法提取這些克隆的質粒。5.高比潘植黢,的DNA片段的分析及活性驗證將前述提取的質粒采用EcoRI內切嗨進行酶切，之后克隆入pUC18載體(華美生物工程公司)的多克隆位點中，測序，通過生物信息學的手段，分析這些基因的蛋白質序列，找到與之同源的基因。實驗結果表明，在所獲得的3個克隆子中均為同一條基因，且該基因與大腸桿菌的植酸酶appa基因具有較高相似性(同源性為96%)。實施例2,離比活植酸瞎基因的改造及人工合成根據編碼fsc力ew'c/L^co7i植酸酶成熟蛋白的基因序列，按照畢赤酵母密碼子的偏愛性，在不改變其氨基酸序列的前提下進行序列改造，同時在序列中避免富含AT序列(ATTTA、AATAA、AATTAA等)的出現。并按所用克隆載體的多克隆位點設計、添加合適的限制性內切酶位點，將全基因分為A(161bp)、B(287bp)、C(325bp)、D(225bp)、E(235bp)5個部分，再將每個部分分為長度不超過60個核苷酸的單鏈核苷酸片段進行人工合成。基因去掉N-端66bp的信號肽編碼序列后，全長1233bp。按畢赤酵母密碼子偏向，在不改變氨基酸序列的前提下進行改造，共改變了262個堿基涉及229個密碼子，G+C含量由原來的53.7呢變為49.1%，密碼子第三位堿基的G+C含量由原來的54.8%變為48.4%，基本符合畢赤酵母G+C的含量特征。核酸序列《SEQIDNO:1):cagagtgagcctgagttgaaactggaatccgttgtcatcgtctctagacatggtgtt卿60gcaccaaccaaggccacccaacttatgcaagatgtcaccccagacgcttggccaacctgg120ccagtca鄰ctgggttggttgacacctag8ggtggtgagctcattgcttacttgggtcac180taccaaagac鄰cgtcttgttgccgacggattggtggccaagaagggttgtccacaatct240ggtcaagtagctattattgctgacgtcgacg幼3g肌CCCgtaagacaggtgaagccttc300gccgccggtcttgctcctgactgtgccatttctgttcacacccaagttgacacttcttct360ccagatccattgttcaaccctttgaagactggtgtttgccaattggacaacgctaacgtt420actgacgctatcttgtccagagctggaggatccattgctgacttcaccggtcacagacag480actgccttcagBgagttggaaagagttcttaacttcccacaatccaacttgtgccttaag540cgtgagaagc幼gacgaatcctgttccttgactcaagcattaccatctgagttgaaggtc600tccgccgacaacgtctctttgaccggtgctgtcagcttggcttccatgttgactgaaatc660tttcttctgc幼c卿ctcaaggtatgcctgagccaggttggggtagaatcaccgactct720caccaatggaacaccttgttgtccttgcacascgctc犯ttctacttgctgcagagaact780ccagaggttgctagatccag3gcc3ccccattgttggacttgatc卿actgctttgact840cctcacccacctcaaaagcaagcctacggtgttaccttgcccacttctgtcttgttcatt900gccggtcacgatactaacttggcaaatctcggcggtgctttggagttgaactggactctt卿cctggtcaacctgataacactccaccaggtggtgagctcgttttcgaaagatggcgt卿1020ctatctgataactctcaatggattcaggtttcgttggtcttccaaactttgcagcagatg1080agagacaagactccactgtctttgaacacgcctccaggagaagtcaaattgaccttggct1140ggatgtg幼ga豕agaaatgctcagggtatgtgttccttggctggtttcactcaaatcgtt1200aacgaagctag祖atcccagcUgttccgtgtag1233蛋白貭序到(SEQIDNO:2):QSEPELKLESWIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTTOAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGH60YQRQRLVADGLVAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAISVHTQVDTSS120PDPL卿LKTGVCQLD誦VTDAILSRAGGSIADFTG服QTAFRELERVLNFPQSNLCLK180REKQDESCSLHALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDS240HQWNTLLSLH,YLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFI300AGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQM360RDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSV410在基因(SEQIDNO:l)的5'端添加EcoRI位點，3'端添加Notl和HindIII位點，以便于基因克隆到轉移載體pUC19及表達載體pPIC9上。按照基因合成的常規方法，將合成基因各部分分別克隆于載體pUC19上，再進一步拼接得到完整的改造全基因appA-m，重組質粒命名為pUC19-appA-m。a卯A-m基因經序列測定后證實該基因與設計的序列一致。實施例3，離比活植敏嘛基因在酵母中的髙效誘導表達及其分析1.合成片段的拼接及重組表達載體的構建利用EcoRI/NotI酶切位點，將appA-m從pUC19-phyA-m上切下，通過EcoRI/Notl位點克隆到畢赤酵母表達載體pPIC9(Invitrogen)上，得到重組載體pPIC9-appA-m。DNA的重組操作主要依據Sambrook等人，分子克隆實驗室指南進行。2.酵母的電擊轉化及篩選將重組載體pPIC9-即pA-m用BglII酶切使之線性化，電擊轉化畢赤酵母GS115(Iiwitro辦n)。挑取陽性轉化子。電轉化及篩選方法參見Invitrogen公司操作手冊。3.重組酵母的誘導表達重組酵母在5mLBMGY培養基中于30'C搖床培養48h，離心收集菌體，加入lmLBMMY甲醇誘導培養基懸浮菌體，繼續在3(TC下誘導培養48h，取樣檢測各菌株上清液中的植酸酶活性，從中篩選出表達植酸酶的轉化子。酶活性單位定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1/^mol無機磷所需的酶量為一個酶活性單位(U)。酶活性測定方法參見實施例5，酶測定體系pH值為5.0。4.發MR水平植酸,的表達重組酵母在5L發酵罐(BI0STATB5型)中進行發酵。重組酵母的發酵為高細胞密度補料發酵，發酵過程分為菌株培養階段、碳源飼喂階段和誘導表達階段，具體方法見Invitrogen操作手冊。在誘導過程中每12h取樣一次測定表達的植酸酶的積累量并進行表達蛋白的SDS-PAGE。實驗結果表明選擇搖床水平表達量高的畢赤酵母重組菌株P.pastorispPIC9-appA-m74進行5L發酵罐發酵研究。在誘導之前的菌體生長階段發酵上清中檢測不到植簾酶活性。隨著甲醇的誘導，上清液中植酸酶酶活力顯著增加，酶蛋白不斷積累。經甲醇誘導120h后表達量達到2.5mg/mL，植酸酶(AppA-M)活性(發酵效價)達1.2X104U/mL以上，而現有技術大多數植酸酶的活性最高僅在8000U/ml。5.表達,轤黢瞎的SDS-PAGE分析及脫糖基化處理取在搖床誘導表達48h后的培養液，離心取8"L上清液進行SDS-PAGE分析。取9uL上清液進行脫糖基化處理，建立如下反應體系9"L上清液加lnLlOXGlycoprotein變性緩沖液，IO(TC反應10min后加1.2uL10XG5緩沖液、1liLEndoH,37。C反應lh。實驗結果表明通過SDS-PAGE鑒定植酸酶蛋白的表達，從SDS-PAGE電泳上可看到畢赤酵母表達的植酸酶有三條大小不同的蛋白條帶，其表觀分子量分別為50kD、52kD和54kD左右，均比從氨基酸序列推斷出的理論分子量(約45kD)大。分析該植酸酶的氮基酸序列，發現有三處潛在糖基化位點，所以有可能是因糖基化造成分子量偏大，而不同程度的糖基化造成表達蛋白分子量的差異。6.重組賺母的Southern印跡和Nortern印跡選取不同的轉化子及宿主菌株GS115分別接種于BMGY培養基中，3(TC搖床48h培養后提取基因組DNA;BMGY培養基中3(TC搖床培養48h，離心收集菌體后，BMMY中30'C誘導培養48h，提取酵母總RNA。用植酸酶基因Xball/Pstl酶切回收片段(+50+785bp)為探針分別進行Southern印跡和Nortern印跡分析。實驗結果表明重組酵母中植酸酶基因得到了轉錄，轉錄的mRNA量在高表達重組子和低表達重組子中沒有顯著差異。實施例4，離比活植酸瞎酶學性質檢測畢赤酵母表達的植酸酶純化方法如下首先進行脫鹽處理，再經分子篩Superdex—75—HR—10/30純化。分步收集洗脫峰，每管lmL,作為植酸酶酶學性質研究的樣品。經純化的植酸酶在不同pH及不同溫度條件下進行酶促反應以測定其最適pH和最適溫度。將酶液在不同pH值的緩沖液中于37。C下處理lh及在不同溫度(60。C、70°C、8(TC)下分別處理30min，在37。C、pH5.0的條件下分別測定酶活性以測定酶的pH穩定性和酶的熱穩定性。酶的比活單位的定義為每mg酶蛋白所表現出的酶活性單位(U)。通過考馬斯亮藍法測定樣品酶液中的蛋白含量，同時測得其植酸酶酶活性，由此得到酶的比活性。用不同濃度的植酸鈉為底物，在pH5.0、37C條件下反應lOrain測定酶活性，計算出酶的《值及Fax。在酶促反應體系中加入終濃度為lmM不同的金屬離子及化學試劑，在37。C、pH5.0條件下測定酶活性，研究其對酶活性的影響。用pH2.0Gly-HC1緩沖液配制0.lmg/mL胃蛋白酵，pH7.0Tris-HC1緩沖液配制0.lmg/mL胰蛋白酶。取0.5mL純化后的植酸酶酶液，分別加入0.5raL胃蛋白酶和胰蛋白酶，37'C保溫，不同時間取樣，37°C、pH5.0條件下測定酶活性。實驗結果表明，該重組植酸酶AppA-M的比活性為3.19X103U/mg，Km=0.55mmol/L，Vmax=3.934X103U/(mgmin)。最適pH為4.5，當pH大于6時，酶活迅速降低；在pH210之間酶活均能維持在8(^以上，具有很好的pH穩定性。在pH5.0，不同溫度下酶活性的測定結果表明，該酶的最適反應溫度為60°C。在6(TC下保溫30min，剩余酶活性為40%，70。C和80。C下保溫30min，剩余酶活性降為15%。在酶促反應體系中加入不同的化學試劑，然后分別測定酶活性，結果表明，Mg2+、Ca2+和EDTA對AppA-M有激活作用，酶活性分別促進13%，12%和16.9%;金屬離子Zn2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+和Fe3+對AppA-M的酶促反應均有不同程度的抑制作用，而SDS完全抑制了其植酸酶活性。植酸酶AppA-M用胃蛋白酶處理120min后，酶活性提高了17%;用胰蛋白酶處理120min后，剩余32.8%的酶活性。說明植酸酶AppA-M具有非常好的抗胃蛋白酶水解能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力。并且，經過測定，與大腸桿菌的appa蛋白相比較，本發明的高比活植酸酶的酶活提高了約50%。實施例5，植酸瞎,活測定方法1.方法簾理植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的(NH丄P04NH4V03*16MO03復合物，在波長415nm下進行比色測定。2.試劑和裕液本方法中所用試劑，在沒有注明其它要求時，均指分析純試劑和符合GB/T6682中規定的三級水。并且，清洗試驗用容器不要用含磷清洗劑。2.10.25mol/L乙酸緩沖液(l):稱取34.02g三水乙酸鈉于1000ml容量瓶中，加入900ml水溶解，用鹽酸調節pH至5.0士0.01，并用蒸餾水定容至1000ml，室溫下存放2個月有效。2.20.25mol/L乙酸緩沖液(2):稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5gTritonX-100，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水溶解，用鹽酸調節pH至5.0±0.01，并用蒸餾水定容至1000ml，室溫下存放2個月有效。2.37.5mmol/L植酸鈉(底物)溶液稱取O.6929g肌醇六磷酸鈉(CJW)24P6Na,2)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸緩沖液(l)溶解并定容至刻度，調pH值到5.0，現用現配(實際反應液中的最終濃度為5.0ramol/L)。2.4硝黢溶液l:2水溶液。2.5100g/L鉬酸銨溶液稱取10g鉬酸銨[(肌)6MoA4犯20]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(2590用水溶解定容至刻度。2.62.35g/L釩酸銨溶液稱取0.235g釩酸銨(NH4V03)于100ml棕色容量瓶中，加入2磁1硝酸溶液，用水溶解定容至刻度。避光條件下保存l周有效。2.7顏色終止液移取2份硝酸溶液，l份鉬酸銨溶液，l份釩酸銨溶液混合后使用，現用現配。2.8磷酸二氫鉀(KH2P0J:基準物。3儀器和設備3.1實驗室常用儀器設備。3.2恒溫水浴37±0.1°C。3.3分光光度計；有10mm比色皿，可在415nm下測定吸光度。3.4磁力攪拌器。3.5渦流式混合器。3.6酸度計精確至小數點后2位。3.7離心機轉速為4000r/min以上。4.試樣翻備取植酸酶樣品，用常規的四分法將試樣縮分至200g，植酸酶產品不需粉碎，配合飼料和添加劑預混合飼料需粉碎通過0.45mm標準篩，裝入密封容器，防止試樣成分變化。5.測定歩據5.1絕對法5.1.1標準曲線準確稱取O.6804g在105'C烘至恒重的基準磷酸二氫鉀于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸緩沖液溶解，并定容至100ml，濃度為50.Ommol/L。按下面表2的比例稀釋成不同濃度，與試樣一起反應測定，以吸光值為橫坐標，反應體系中無機磷的量("mol)為縱坐標，列出直線回歸方程(y:ax+b)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>5.1.2試樣溶液的制備稱取試樣兩份，每份1.0000g，精確至O.OOOlg，置于100ml容量瓶中，加入約70ml乙酸緩沖液(2)，一個磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌30min，用乙酸緩沖液(2)定容至刻度(減去磁力棒的體積)。搖勻，在離心機上以4000r/min離心10min。分取不同體積的上清液用乙酸緩沖液(2)稀釋，使樣液濃度保持在0.4U/ml左右，待反應。前述植酸酵純化后經使用乙酸緩沖液(l)按照以上步驟稀釋。5.1.3反應取10ml試管按下面的反應順序進行操作，在反應過程中，從加入底物開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，37'C水解30min。反應步驟及試劑、溶液用量見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>5.1.4樣品測定反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現混濁需在離心機以上4000rpm離心10min，上清液以標準曲線的空白調零，在分光光度計415nm波長處測定樣品空白(A。)和樣品溶液(A)的吸光值，A-A。為實測吸光值。用直線回歸方程計算植酸瞎的活性。6結果計算和表示6.1計算公式試樣中植酸酶的活性，用每克(或mL)試樣中的活性單位"U"表示，計算公式如下。植酸酶活性(1{/8)=-2-XF,、MX30X0.2...........................(1)式中c——根據實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的y值；F——試樣溶液反應前的總稀釋倍數；0.2——0.2ml酶稀釋液(步驟5.1.2);M-樣品質量；30——反應時間(分鐘)。實施例6:蛋白變體采用常規的方法，在本發明的AppA-M蛋白的N端加上6個組氨酸標簽(His-6)，在使用常規方法表達出N端攜帶組氨酸標簽的AppA-M蛋白后，使用Ni-NTA親和層析將被組氨酸標簽的靶肽進一步純化。洗脫并收集純化產物，按實施例4和5所述的方法，測定所獲得的AppA-M蛋白的酶學活性和PH穩定性，結果表明所述的攜帶組氨酸標簽的AppA-M蛋白與不帶組氨酸標簽的AppA-M蛋白活性相近，且也具有良好的酶活性以及PH穩定性。實施例7,含有高比活的植酸酶的飼料配制植酸酶組合物(5000型顆粒產品)如表4:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>將上述各成分充分混合，根據常規的方法制成顆粒飼料產品。按以下表fi配方，用常規方法制備蛋雞用飼料(含量Wt%)，采用的植酸酶組合物為前述配制的5000型顆粒產品表5<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>將上述對照組和實驗1組各原料充分混合，按照常規方法制成飼料。實施例8:動物試驗將實施例7制備的含有高比活植酸酶的試驗1組飼料以及對照組飼料分別喂食蛋雞。結果發現，與對照組詞料相比，動物在食用試驗l組飼料后，在加入所述5000型顆粒產品后飼料中可少加入約65%的磷酸氫^，較大地降低了成本；并且該種飼料還能夠提高蛋雞的生長速度，降低料肉比，使飼養人員得到更多的經濟效益。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉四川禾本生物工程有限公司<120>高比活植酸酶基因及其應用<130〉070926<160〉2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1233<212>畫<213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature<223>植酸酶綦因<400〉1cagagtgagcct鵬ttgaaactggaatccgttgtcatcgtctctagacatggtgttaga60gC3CC幼CC3ag豕ccacccaacttatgcaagatgtcaccccagacgcttggccaacctgg120ccagtcaagctgggttggttgacacctagaggtggtgagctcattgcttacttgggtcac180tacc幼agacagcgtcttgttgccgacggattggtggccaagaagggttgtccacaatct240ggtcaagtagctattattgctgacgtcgacgaaagaacccgtaagacaggtgaagccttc300gccgccggtctt豕ctcctgactgtgccatttctgttcacacccaagttgacacttcttct360ccagatccattgttcaaccctttgaagactggtgtttgccaattgg3caacgctaacgU420actgacgctatcttgtccagagctggaggatccattgctgacttcaccggtcac3gacsg480actgccttcaga砂gttgga幼gagttcttaacttcccacaatccaacttgtgccttaag540cgtgagaagcaa豕acgaatcctgttccttgactcaagcattaccatctgagttg犯ggtc600tccgccgacaacgtctctttgaccggtgctgtcagcttggcttccatgttgactga肌tc660tttcttctgcaacaagctcaaggtatgcctgagccaggttggggt卿atcaccgactct720caccaatggaacaccttgttgtccttgcacaacgctcaattctacttgctgcagagaact780ccagaggUgctagatxcagagccaccccattgttggacttgatc犯gactgctttgact840CCtX3CCC3Cctc貼幼gcaagcctacggtgttaccttgcccacttctgtcttgttcatt900gccggtcacgatactaacttggcaaatctcggcggtgctttggagttg肌ctggactctt960cctggtcaacct辟taacactccaccaggtggtgagctcgttttcgaaagatggcgtaga1020ctatctgataactctcaatggattcaggtttcgttggtcttccaaactttgcagcagatg1080ctccactgtctttgaacacgcctccaggagaagtca犯ttgaccttggct1140ggatgtgaagagaga幼tgctcagggtatgtgttccttggctggtttcactcaaatcgtt1200g幼tcccagcUgUccgtgtag1233<210>2<211>410<212>PRT<213>人工序列<220〉〈221〉MISC一F畫RE<223><400〉2GinSerGlu1HisGlyValThrProAsp35ProArgGly50ArgLeuVal65GlyGinValGlyGluAlaHisThrGin115LysThrGly130LeuSerArg145ThrAlaPheLeuCysLeuAlaLeuPro195GlyAlaVal210GinAlsGin225HisGinTrpLeuGinArgAspl>eulie275TyrGlyVal290ThrAsnLeu305ProGlyGinArgTrpArgProGlu5ArgAls20AIbTrpGlyGluAlaAspAlalie85PheAla100ValAspValCysAlaGlyArgGlu165LysArg180SerGluSerLeuGlyMetA抑Thr245ThrPro260LysThrThrLeuAlaAsnProAsp325ArgLeu340LeuLysLeuGluSerValVallieValSerArg1015ProThrLysAlaThrGinLeuMetGinAspVal2530ProThrTrpProValLysLeuGlyTrpLeuThr4045LeulieAlaTyrLeuGlyHisTyrGinArgGin5560GlyLeuValAlaLysLysGlyCysProGinSer707580lieAlaAspValAspGluArgThrArgLysThr9095AlaGlyUuAlaProAspCysAlalieSerVal105110ThrSerSerProAspProLeuPheAsnProLeu120125GinLeuAspAsnAlaAsnValThrAspAlalie135140GlySerlieAlaAspPheThrGlyHisArgGin150155160LeuGluArgValLeuAsnPheProGinSerAsn170175GluLysGinAspGluSerCysSerLeuThrGin185190LeuLysValSerAlaAspAsnValSerLeuThr200205AlaSerMetLeuThrGluliePheLeuLeuGin215220ProGluProGlyTrpGlyArglieThrAspSer230235240LeuLeuSerLeuHisAsnAlaGinPheTyrLeu250255GluValAlaArgSerArgAlaThrProLeuLeu265270AlaLeuThrProHisProProGinLysGinAla280285ProThrSerValLeuPhelieAlaGlyHisAsp295300LeuGlyGlyAlaLeuGluLeuAsnTrpThrLeu310315320AsnThrProProGlyGlyGluLeuValPheGlu330335SerAspAsnSerGinTrplieGinValSerLeu345350ValPheGinThrUuGinGinMetArgAspLysThrProLeuSerLeu355360365AsnThrProProGlyGluValLysLeuThrLeuAlaGlyCysGluGlu370375380ArgAsnAlaGinGlyMetCysSerLeuAlaGlyPheThrGinlieVal385390395400AsnGluAlaArglieProAlaCysSerVal405410權利要求1.一種分離的蛋白，其特征在于，該蛋白選自下組(a)具有SEQIDNO2氨基酸序列的多肽；或(b)將SEQIDNO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有與SEQIDNO2氨基酸序列的多肽同種功能的由(a)衍生的多肽。2.—種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組(i)編碼衩利要求l所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。5.—種載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的多核苷酸。6.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求5所述的載體；或它的基因組中整合有權利要求2所述的多核苷酸。7.權利要求l所述的蛋白的用途，其特征在于，用于分解植酸或植酸鹽。8.—種制備權利要求l所述的蛋白的方法，其特征在于，該方法包括培養權利要求6所述的宿主細胞，收集獲得權利要求1所述的蛋白。9.一種組合物，其特征在于，所述組合物中含有有效量的權利要求l所述的蛋白，以及食品學或飼料學上可接受的載體。10.—種制備含有權利要求l所述的蛋白的轉基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟將權利要求2所述的多核苷酸導入植物細胞中，培養所述的植物細胞，再生成植物。全文摘要本發明公開了一種新的AppA-M蛋白及其應用，所述的AppA-M蛋白是一種高比活的植酸酶，可用于分解植酸或植酸鹽。本發明還公開了編碼AppA-M蛋白的基因，含有所述基因的載體以及宿主細胞。所述的AppA-M蛋白在飼料添加劑等領域具有廣泛的應用前景。文檔編號A23L1/305GK101260390SQ20071003782公開日2008年9月10日申請日期2007年3月6日優先權日2007年3月6日發明者鋼李,滔楊,王小行,彥蔣,鄧運濤申請人:四川禾本生物工程有限公司