專利名稱：羧化多糖的交聯方法
技術領域：
本發明涉及一種羧化多糖的交聯方法。
本發明的方法提供所得產品在交聯程度、交聯鏈分布均勻性和產品化學物理性質以及從中所得制品技術特征方面的高度再現性。
再現性對在醫學、藥學和皮膚化妝品領域中的應用是非常重要的。
本發明還涉及可通過所說方法獲得的產品以及它們在醫學、藥學和皮膚化妝品領域中的用途。
關于它們的特征以及藥物用途的回顧，可參見1)C.Hansch等編-″綜合醫藥化學″-Pergamon出版社，牛津，1990-Vol.1-6；2)A.Wade和P.J.Wellers編-″藥用賦形劑手冊″-1994-藥學出版社。
所說的大分子屬于不同的化學類物質并且可以是合成的或天然的或者半合成的。
合成大分子的實例包括聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯烷基醚、聚乙烯基醇、聚甲基丙烯酸酯。天然大分子的實例包括天然透明質酸(HY)和纖維素。
半合成大分子的實例包括羧基烷基纖維素，其廣泛地用于食品和個人護理品工業。這些大分子的特征在于具有直鏈或較少支鏈的結構。
通過交聯可以為增加化學、酶性和機械強度提供非常重要的改性，交聯可以合成和天然聚合物(或多或少已被改性)為基料進行。
交聯聚合物的實例包括用于胃保護片劑或膠囊劑的聚合物(聚甲基丙烯酸酯)，以及用作乳化劑、懸浮劑、片劑硬化劑的聚合物(聚羧乙烯)；交聯的透明質酸，下面將作討論。
考慮到其應用，特別是為制備非胃腸道使用的侵入性醫用器具，所說的聚合物必須滿足很多技術和規范類型的要求。
技術要求包括1)高的生物相容性2)耐受酶體系，無論是組織或血漿的(對可注射用組合物來說)還是胃腸的(對口服組合物來說)。
在一些情形中，可能期望逐漸降解，例如藥物的緩釋。
當必須長時間持續的組合物/制品中存在大分子時，這種耐受性是非常重要的，所說的組合物/制品例如在不同類型的手術、組織工程(人造器官)、人造皮膚中，在治療燒傷中并且通常美容手術中，作為組織防粘連劑的滑液代用品、膜、海綿或凝膠；3)可模塑成不同形狀(凝膠、膜、海綿狀等)；4)可以化學或物理滅菌而不改變產品的結構。
根據規則要求，不同生產批次的組合物必須在非常窄的限度內保持恒定；這意味著生產方法要標準化并且基本組分具有非常低的內在可變性。
大分子不均勻的原因可能來自分子量的分散。交聯的結果使所說的不均勻性變得更高。這對使用領域和最終產品的應用目的來說是嚴重缺陷。
EP-A-566118(Kimberly-Clark)公開了一種被用作尿布或類似制品超吸收劑的交聯多糖。
這里所述的方法以通過多胺、多元醇或其混合物與多糖羧基之間形成分子間酰胺、酯或醚來交聯纖維素為基礎。
反應通過將多糖與多元醇和/或多胺的混合物加熱至約80℃來進行。該方法肯定是經濟的并且適合于再現性需求不太嚴格的大型生產。
US5465055公開了通過酯化多糖的COOH和其它分子的OH基團而不插入交聯臂獲得的交聯多糖(透明質酸和藻酸)。
WO91/9119公開了用于作為生物雜交器官的朗氏島的微膠囊，由鋇離子交聯的藻酸組成。
EP190215公開了用二官能或多官能的環氧化物交聯不同聚合物(羧基化淀粉、葡聚糖、纖維素)。
以下提出了用于透明質酸的交聯劑US4716224、4772419、4716154中公開的多官能環氧化物；US4957744公開的多元醇；US4605691、4636524中公開的二乙烯基砜；US4713448和4582865中公開的醛類；US5356833公開的甲酰胺；EP-A-718312中公開的聚羧基。
本發明公開本發明涉及一種交聯多糖的制備方法，其中所說的多糖含有羧基，該方法允許最終產品的交聯度得到完全控制以及在恒定特征方面具有高的再現性。
本發明的方法包括a)通過與適宜的羧基活化劑在無水質子惰性溶劑中反應，使多糖的羧基活化；b)將羧基活化的多糖與多胺反應。
如果需要，可以對所得的交聯多糖進行游離羥基的硫酸化或半琥珀酰化處理。
通過本發明方法獲得的產品還可以與金屬離子絡合，例如鋅、銅或鐵離子。
本發明使用的含羧基的多糖可以是天然、合成或半合成多糖。所說多糖的實例包括透明質酸(得自組織或細菌)；羧甲基葡聚糖；羧甲基纖維素；羧甲基淀粉；藻酸；纖維素酸；N-羧基-甲基或丁基葡聚糖或殼聚糖；不同分子量的肝素、選擇性地脫硫酸化和琥珀酰化；硫酸皮膚素；硫酸軟骨素；硫酸乙酰肝素；聚丙烯酸。
特別優選透明質酸、羧甲基纖維素、肝素、藻酸和聚丙烯酸。
通過不同方法獲得的所說交聯聚合物是已知的并且已被提出有許多用途(例如參見如上所述的EP566118、WO91/9119、US5465055、EP190215、EP718312、US4716224)。
羧基活化劑為肽化學中常用的活化劑適宜活化劑的實例包括羰基二咪唑、羰基三唑、氯甲基吡啶鎓碘化物(CMP-J)、羥基苯并三唑、對硝基苯酚對硝基苯基三氟乙酸鹽(酯)、N-羥基琥珀酰亞胺等等。特別優選使用氯甲基吡啶鎓碘化物。
多胺優選具有以下通式R1-NH-A-NH-R2其中R1和R2相同或不同，是氫；C1-C6烷基；苯基或芐基，A是C2-C10亞烷基鏈，優選C2-C6亞烷基鏈、選擇性地取代有羥基、羧基、鹵素、烷氧基、氨基；下式的聚氧亞烷基鏈[(CH2)n-O-(CH2)n]m其中n是2或3，且m是2-10的整數；C5-C7環烷基；芳基或雜芳基，優選1,3或1,4-取代的苯。A優選是C2-C6直鏈亞烷基或下式的鏈[(CH2)n-O-(CH2)n]m交聯反應優選在溶劑中進行，所說的溶劑選自四氫呋喃、二甲基甲酰胺或二甲基亞砜，并且多糖優選與親油性陽離子例如四烷基銨或其它親油性有機堿成鹽。
無機鹽如鈉鹽轉化成適宜有機親油性鹽可以通過已知的離子交換方法在均相中完成或者通過酸組分沉淀、隨后回收后者并且與所需的有機堿成鹽來完成。
羧基的活化反應在均相中并且在無水極性質子惰性溶劑中進行。
將在相同無水溶劑中稀釋的多胺添加到被活化酯的溶液中，保持溫度0-30℃。交聯反應時間為1-12小時，還取決于非必需存在的適宜的堿性物質(如三乙胺)。
通常來說，通過向反應溶劑中添加不同溶劑使有機鹽沉淀或者通過將反應溶劑蒸發，接著離心，用蒸餾水洗滌，重復分散在所需堿的溶液中(例如鈉、鉀)，隨后用水洗滌，最后將堿性鹽真空干燥或凍干，來回收最終的產品。
交聯度(C.L.D)可以是很寬的范圍，并且可以通過改變羧基活化劑的量來調整，因為活化和交聯反應是基本上定量的。
可以對本發明獲得的交聯多糖中可能存在的羥基進行硫酸化反應，通常是通過與存在于二甲基甲酰胺中的吡啶-三氧化硫復合物反應。
反應在非均相中于0-10℃下反應約0.5-約6小時。
所獲得的硫酸化程度根據總的羥基數具有很寬的范圍，并且可以通過改變溫度和反應時間來調整。通常來說，硫酸化程度(定義為硫酸根基團當量/g)可以為1×10-6至6×10-6，對0.5的交聯度來說硫酸化程度優選為2×10-6當量/g。
非必需地硫酸化的本發明獲得的交聯聚合物能夠絡合諸如鋅、銅或鐵離子的金屬離子。
所說絡合物的獲得可以是通過將產品溶解或分散在水中直至完全溶脹，并且邊攪拌邊添加有機或無機金屬鹽如CuCl2、ZnCl2、Fe2(SO4)的濃縮溶液，優選在室溫下；攪拌12-24小時之后，通過離心或添加不同溶劑(如乙醇或丙酮)沉淀或真空蒸發回收絡合物；將回收的粗產物用蒸餾水徹底洗滌以便除去過量的離子。然后，將絡合物凍干。金屬離子的含量取決于所用的操作條件而不同，特別是取決于聚合物與離子的摩爾比；溶液的濃度和pH；反應時間并且尤其是交聯度。
本發明的方法通過適宜地調整交聯度和/或硫酸化程度，可以制備各式各樣形狀的交聯羧化多糖，其特征在于具有不同的特征，諸如粘彈性、水合程度，絡合金屬離子的能力，形成水凝膠的能力、可模塑成膜或海綿狀物、最終材料的機械強度。
從而使它們可以在很多藥學領域(人和獸醫領域)和在皮膚化妝技術中使用。
以下實施例進一步對本發明作舉例說明。實施例1用1,3-二氨基丙烷100％交聯的羧甲基纖維素凝膠將1.2×10-3mol雙糖單元的羧甲基纖維素(cellulare)TBA鹽在氮氣環境下溶解于30ml DMF中并且攪拌。將溶解于2m1 DMF中的0.32g氯甲基吡啶鎓碘化物(1.2×10-3mol)滴加到用冰保持在0℃的上述溶液中。
由于羧甲基纖維素中每雙糖單元具有一個羧基官能團，因此摩爾比為1比1。20分鐘后，溶液中加入2ml交聯用1,3-二氨基丙烷(0.006mol)，之后立即加入0.5ml三乙胺。形成固體膠凍狀產物，用DMF洗滌，然后放入H2O中完全溶脹。
或者，用EtOH和H2O洗滌。經過最后一次用EtOH洗滌之后，將產物冷凍干燥。-I.R.(膜；cm-1):1650(-CO-NH-)；在1.400周圍沒有彎曲的-COO--SD(溶脹度，在水中并且室溫下，15’之后，重量分析測定；根據SD=[(Ws-Wd)/Wd]×100計算，其中Ws=水合凝膠的重量，Wd=干凝膠重量)7.000-SEM(掃描電子顯微鏡檢查)結構看似致密，存在15-35μpers-產品表面，通過兔子PRP(富含血小板的血漿)接觸，與通過低密度聚丙烯(EC參照標準)獲得的同等產品相比，存在非常少的血小板或凝集物。
20分鐘后，溶液中加入2ml交聯用1,3-二氨基丙烷(3×10-3mol),之后立即加入0.5ml三乙胺。形成固體膠凍狀產物，用DMF洗滌，然后放入H2O中完全溶脹。
或者，用EtOH和H2O洗滌。經過最后一次用EtOH洗滌之后，將產物冷凍干燥。-I.R.(膜；cm-1):1650(-CO-NH-)；在1.400周圍沒有彎曲的-COO--SD:8.000-SEM存在15-35μpers-血小板粘著性如實施例1。
將1.2×10-3mol單糖單元的藻酸TBA鹽在氮氣環境下溶解于30mlDMF中并且攪拌。將溶解于2ml DMF中的0.36g氯甲基吡啶鎓碘化物(1.2×10-3mol)滴加到用冰保持在0℃的上述溶液中。摩爾比為1/1。
20分鐘后，溶液中加入6×10-3mol交聯用1,3-二氨基丙烷(0.0024mol)，之后立即加入0.5ml三乙胺。形成固體膠凍狀產物，用DMF洗滌，然后放入H2O中完全溶脹。
或者，用EtOH和H2O洗滌。經過最后一次用EtOH洗滌之后，將產物冷凍干燥。-I.R.(膜；cm-1):1635(寬峰)(-CO-NH-)；1.400周圍(-COO-)-SD:5.000-SEM結構看似致密并且沒有孔。
將透明質酸鈉鹽(1×10-3mol，對雙糖單元而言)按如下方法之一轉變成TBA鹽a)通過H+強陽離子樹脂(Amberlite IR 120)將1％的透明質酸鈉水溶液轉變成H+形式；用0.5％的TBA-OH溶液將最后的溶液處理至約pH=9。
b)通過用TBA+形式的弱陽離子樹脂(Amberlite IRC 50)處理，將1％的透明質酸鈉水溶液轉變成TBA鹽溶液。
兩種情況中，將最終的溶液凍干。然后在氮氣環境下將TBA鹽溶解于15ml無水DMF中，將0℃的于2ml無水DMF中的0.02g氯甲基吡啶鎓碘化物(CMPJ)滴加到TBA鹽的存儲溶液中。
然后，反應混合物中加入0.1ml三乙胺，然后滴加1,3-二氨基丙烷(d=0.88，過量，以便使活化羧基的交聯更容易)在2ml無水DMF中的溶液。當添加完畢后，將反應混合物攪拌至少30’，然后減壓除去溶劑，用DMF提取殘余物，隨后蒸餾除去DMF；然后用乙醇、乙醇-水，最后用水處理殘余物。
將產品凍干然后對殘余物進行分析。-I.R.(膜；cm-1):1630(-CO-NH-)；1740(-COOH，多糖)；3200(-NH-)-SD(溶脹度，在水中并且室溫下，15’之后，重量分析測定；根據SD=[(Ws-Wd)/Wd]×100計算，其中Ws=水合凝膠的重量，Wd=干凝膠重量)31.000-交聯度0.05(5％初始可獲得的羧基)。
活化劑氯甲基吡啶鎓碘化物。
按照實施例4所述的過程和條件，使用相同的HY和相同的活化劑，但用1,6-二氨基己烷代替1,3-二氨基丙烷，獲得交聯的衍生物。-I.R.(膜；cm-1):1630(-CO-NH-)；1740(-COOH，多糖)；3200(-NH-)。實施例6制備C.L.D=0.05(5％可獲得的羧基)的交聯透明質酸。交聯劑0.0’-二-(2-氨基丙基)PEG500。活化劑氯甲基吡啶鎓碘化物。
按照實施例4所述的過程和條件，使用相同的活化劑，但用0.0’-二-(2-氨基丙基)PEG500代替1,3-二氨基丙烷，獲得交聯的衍生物。-I.R.(膜；cm-1):1630(-CO-NH-)；1740(-COOH，多糖)；3200(-NH-)SD:31.000。
將0.6g透明質酸三丁基銨鹽(1×10-3mol，對雙糖單元而言)在氮氣環境下攪拌溶解于30ml DMF中。將溶解于2ml DMF中的0.08g氯甲基吡啶鎓碘化物(3.5×10-4mol)滴加到保持在0℃的上述攪拌溶液中。由此，摩爾比為約3/1。
20分鐘后，加入2ml 1,3-二氨基丙烷(0.024mol)，接著立即加入0.5ml三乙胺。獲得固體凝膠狀產物，然后用水溶脹之并且再用乙醇洗滌。
凍干后的最終產品在掃描顯微鏡下顯出不規則的圖案，光滑區域與海綿狀區域交替。
交聯度為0.3(30％初始可獲得的羧基)-I.R.(膜；cm-1):1740(-COOH)；1630(-CO-NH-)；1610(-COO-)；1560(-CO-NH-)。
將0.6g透明質酸三丁基銨鹽(HY TBA)(1×10-3mol，對雙糖單元而言)在氮氣環境下攪拌溶解于30ml DMF中。將溶解于2ml DMF中的0.15g氯甲基吡啶鎓碘化物(CMPJ)(6×10-6mol)滴加到上述溶液中，保持在0℃。摩爾比為2 HY.TBA:1 CMPJ。20分鐘后，向溶液添加2ml 1,3-二氨基丙烷(0.024mol)，之后加入0.5ml三乙胺。
獲得固體凝膠狀產物，并且用DMF徹底洗滌。
蒸發DMF之后，將產品在水中溶脹并且用乙醇洗滌，然后凍干。
所得產品的交聯度為0.5，并且在掃描顯微鏡下顯示具有被大孔間隔的粒狀外觀，在較高幅度下，這兩種形態似乎相同并且顯出直幾微米的圓形突起。-I.R.(膜；cm-1):1740(-COOH)；1630(-CO-NH-)；1610(-COO-)；1560(-CO-NH-)將凝膠在PBS中溶脹并且評價最大溶脹能力。SD=23.500NMR=(13C；ppm):29.3和39.8(-CH2-CH2-CH2-丙二胺鏈接)；172.5(-CO-NH-CH2-CH2-CH2-)在Bohlin VOR流變儀上評價流變特性，溫度23±0.1℃，顯示在兩個被考慮濃度(10和20mg/ml)下相同的動態彈性模量G’(10Hz下100Pa)總是高于粘性動態模量(G”,10Hz下20mg時為40Pa,10Hz下10mg時為20Pa)。
所得的衍生物具有如下特性表1
實施例1350％交聯HY的硫酸化。
在強烈攪拌和氮氣環境下將實施例8獲得的衍生物分散在5mlDMF中。
0℃下加入1g SO3/吡啶于mol DMF中的溶液，并且攪拌3小時。添加過量H2O(50ml)并且用0.1M NaOH調節pH至9使反應停止。
用乙醇和H2O徹底洗滌產物，然后凍干。
IR光譜顯示，除起始產物的譜帶外，還存在1260cm-1處的峰和1025cm-1處的較強譜帶。
凝膠在PBS中溶脹，SD=33.000。較高分辨率的13C NMR光譜顯示了表2中所示的在37℃水中的信號。29.3和38.8ppm處的NMR信號(-CH2-)強度和172.5ppm處的信號(CONH)證實了交聯度為約50％。
流變特性由動態彈性模量G’(10Hz下20mg時為2500Pa,10mg時為1000Pa)表征，其總是大于動態粘性模量G”(10Hz下20mg時為600Pa并且10mg時為150Pa)，并且明顯高于用非硫酸化HY所獲得的相應值(50％時為13，實施例5)。該化合物的凝血酶時間(TT)(61±5”)高于對照(14.0″)和相應的非交聯化合物(14.6″)。
化合物在使用受激兔子的PRP試驗中也是活性的。表2表13C化學位移
實施例14藻酸凝膠的硫酸化將用EtOH處理之后的交聯產品冷凍干燥，以完全除去水分并且進行羥基的硫酸化。
向分散于5ml DMF中的100mg交聯產品添加800mg在2ml DMF中的SO3-吡啶溶液。反應應當在0℃下于氮氣環境中進行2小時，同時連續攪拌。
強制使產品不吸水分，因為水分可抑制反應。
2小時之后，加入H2O，用1M NaOH溶液將pH調節至9，由此釋放吡啶。
將如此硫酸化的產品在EtOH中純化。
分析純化的產品，顯示-IR(膜，cm-1)1263(伸展的SO)-SO3基團的當量/g凝膠(通過甲苯胺配合物)5％交聯的凝膠6×10-550％交聯的凝膠2×10-5100％交聯的凝膠3×10-5-SD5％交聯的凝膠19×10350％交聯的凝膠9×10-3100％交聯的凝膠7×10-3
表3中描述了硫酸化衍生物的比色特性，同時還包括得自實施例8和13所述產品的比色特性。表3
ΔHa[J/g]水蒸發焓Tg[℃]玻璃化轉變溫度ΔHb[J/g]熱降解過程的焓wt％水分％水含量，基于ΔHa
權利要求
1.一種交聯多糖的制備方法，其中所說的多糖含有羧基，該方法包括a)通過與適宜的羧基活化基團在無水質子惰性溶劑中反應，使多糖的羧基活化；b)將羧基活化的多糖與多胺反應。
2.權利要求1的方法，其中多糖選自透明質酸(得自組織或細菌)；羧甲基葡聚糖；羧甲基纖維素；羧甲基淀粉；藻酸；纖維素酸；N-羧基-甲基或丁基葡聚糖或殼聚糖；不同分子量的肝素、任選地脫硫酸化和琥珀酰化；硫酸皮膚素；硫酸軟骨素；硫酸乙酰肝素；聚丙烯酸。
3.權利要求1或2的方法，其中羧基活化劑選自羰基二咪唑、羰基三唑、氯甲基吡啶鎓碘化物(CMP-J)、羥基苯并三唑、對硝基苯酚對硝基苯基三氟乙酸鹽/酯、N-羥基琥珀酰亞胺。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中多胺具有以下通式R1-NH-A-NH-R2其中R1和R2相同或不同，是氫；C1-C6烷基；苯基或芐基，A是C2-C10亞烷基鏈，優選C2-C6亞烷基鏈、任選地取代有羥基、羧基、鹵素、烷氧基、氨基；下式的聚氧亞烷基鏈[(CH2)n-O-(CH2)n]m其中n是2或3，且m是2-10的整數；C5-C7環烷基；芳基或雜芳基，優選1,3或1,4-取代的苯。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中多糖與親油性陽離子成鹽。
6.權利要求5的方法，其中親油性陽離子是三丁基或四烷基銨。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中交聯反應在無水二甲基甲酰胺或四氫呋喃中進行。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中將所獲得的交聯多糖進一步通過與吡啶/三氧化硫復合物反應進行羥基的硫酸化處理。
9.權利要求8的方法，其中硫酸化反應在二甲基甲酰胺中以均相于0-10℃下反應約0.5-約6小時。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中將任選硫酸化的交聯多糖進一步與鋅、銅或鐵離子的水溶液進行絡合反應。
11.可通過權利要求1-10所述方法獲得的交聯多糖。
全文摘要
本發明涉及一種交聯多糖的制備方法,其中所說的多糖含有羧基,該方法允許最終產品的交聯度得到完全控制以及在常量特征方面具有高的再現性。本方法包括第一步在無水質子惰性溶劑中使羧基活化,然后與多胺反應。所獲得的交聯多糖可以進行五個羥基的硫酸化。
文檔編號C08B37/08GK1325409SQ99813144
公開日2001年12月5日 申請日期1999年11月9日 優先權日1998年11月11日
發明者R·巴布克希, G·斯伯特萊蒂 申請人:阿奎斯蒂奧股份公司