一種羽毛降解細菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于降解羽毛的生物材料及應用領域，特別涉及一種羽毛降解細菌及其應 用。
【背景技術】
[0002] 羽毛主要成分為角蛋白（keratin)，它是一種不溶性的纖維狀動物蛋白質，是外胚 層細胞的結構蛋白，大量以脊椎動物的皮膚、毛發、羽毛、羽莖、蹄、角、爪等結構蛋白存在于 自然界中。我國每年羽毛量在100萬噸以上，禽類所產羽毛除了少部分作為紡織原料等外， 大部分作為廢棄物直接丟棄處理。但羽毛含有許多有用成分，羽毛的粗蛋白含量約在80% 以上，含有豐富的賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、甘氨酸、胱氨酸等10多種動物 所必需的氨基酸，還含有常量元素、微量元素、維生素以及一些未知生長因子。羽毛粉中也 含有較高的能量和較多的B族維生素。因此羽毛廢棄物經過適當的處理具有十分廣泛的用 途。產角蛋白酶的微生物構成的生物煉制較之傳統水解法具有諸如反應條件溫和、產物回 收率高、環境友好、可節省能源等眾多優點。不僅使固體廢棄物得到有效利用，保護了人類 賴以生存的生態環境，還可將其生物降解為多肽及氨基酸等高附加值產品，更加符合循環 經濟的理念和建立節約型社會的戰略要求。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是提供一種羽毛降解細菌及其應用，本發明分離出一 株生產直接降解羽毛的細菌菌株，并利用該菌株發酵處理羽毛廢棄物，反應條件溫和，需要 成本低，對環境友好。
[0004] 本發明的一種羽毛降解細菌，其特征在于：該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為 8&(^11118 81*衍1181098-4，保藏號為061〇：吣.9844，其165冰隱序列如5￡0 10勵.1所 不〇
[0005] 本發明的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis) 1098-4,于2014年10月27日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 9844。
[0006] 本發明在土壤中分離到一株高效降解羽毛微生物，根據BLAST聚類分析及形態學 鑒定結果，將該菌株定命名為枯草芽胞桿菌1098-4,該菌經發明人檢測在合適條件下可完 全降解羽毛。
[0007] 本發明提供的枯草芽胞桿菌1098-4的特征如下：
[0008] 該菌菌落表面干躁，邊緣不整齊；呈乳白色不透明；呼吸類型為好氧呼吸，在有氧 條件下生長良好，革蘭氏染色呈陽性，形態觀察菌體圓柱形桿狀，菌體長度為1. 717ym。測 定菌株的16SrRNA部分序列，進行系統發育學分析（菌株的16SrRNA序列見表1)。
[0009] 本發明的一種羽毛降解細菌的應用，應用于降解羽毛，具體工藝為：將枯草芽孢 桿菌Bacillussubtilis1098-4接種于發酵培養基，37°C，通氣量3-5L/min，攪拌速度為 120-600rpm，培養24-72小時，終止發酵，過濾或離心，得到羽毛降解液。
[0010] 所述發酵培養基為：每lOOmL培養基中含葡萄糖lg、羽毛3. 0g、NaCl0? 0294g、磷 酸氫二鈉0. 4g、磷酸二氫鉀0. 03g，100ml去離子水，pH7. 4-7. 8。
[0011] 培養24-72h后，測得角蛋白酶的最高酶活達30. 3U/mL。
[0012] 有益效果
[0013] 本發明分離出一株生產直接降解羽毛的細菌菌株，并利用該菌株發酵處理羽毛廢 棄物，反應條件溫和，需要成本低，對環境友好。
【附圖說明】
[0014] 圖11098-4菌株形態圖；
[0015] 圖21098-4菌株16SrRNA序列系統發育樹。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0017] 實施例1
[0018] 新菌株枯草芽孢桿菌1098-4(Bacillussubtilis1098-4,已保藏在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號是：CGMCCNo. 9844。
[0019] 菌種來源：本菌種來源于禽類養殖場土壤中，具體分離方法如下：
[0020] (1)富集取羽毛堆積地腐土壤lg于富集培養基（牛肉膏0. 5g、蛋白胨lg、氯化鈉 0. 5g，pH7. 0~7. 6)中，于28°C、120轉/min恒溫培養48h;再取其培養液2mL轉入富集培 養基2中，28°C，120轉/min進一步富集培養48h;
[0021] (2)初篩取終富集液100yL涂布于磷酸消解蛋白培養基平板，篩選出生長的單菌 落；
[0022] (3)復篩將初篩得到的菌種分別點接于磷酸消解蛋白培養基平板和羽毛粉平板 培養基平板，于30°C下恒溫培養48h，對照觀察兩平板上的菌種生長，選定有效菌株；再將 有效菌株涂布于磷酸消解蛋白培養基平板，重復幾次做進一步的分離純化，最后獲得菌株 1098-4;所述有效菌株為在羽毛粉平板培養基上能與磷酸消解蛋白培養基平板生長一樣良 好的菌株；菌種鑒定：（1)菌落形態觀察將菌株1098-4在牛肉膏蛋白胨平板上進行劃線分 離，于33°C下恒溫培養48h，觀察菌落的形狀、顏色、表面質地、菌落邊緣等并記錄；
[0023] (2)菌體形態觀察將菌株1098-4制片，進行革蘭式染色后，用帶拍攝裝置的光學 顯微鏡觀察菌體的形狀、大小、及其特殊構造，并拍攝菌體染色照片；
[0024] (4)分子鑒定
[0025] ①菌株DNA的提取方法
[0026]A、取lml細菌過夜培養液移至1. 5mL的Eppendorf管中，5000rpm離心10分鐘，去 上清液；
[0027]B、立即加入600yL預熱的提取緩沖液，混勻后，65°C溫浴lh;
[0028]C、冰浴冷卻（5分鐘），加入600yL酚/氯仿（1:1)溶液，顛倒混勻后，靜置lOmin， 然后 12000rpm離心 6min;
[0029]D、上清轉移至另一個Eppendorf管中，加入等體積氯仿，靜置5min，12000rpm離心 5min;E、取上清液，加入等體積異丙醇，沉淀DNA;
[0030] F、用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于500yLTE或重蒸水 中，-20 °C保存；如DNA沉淀無法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉淀；
[0031] ②16SrRNA的基因擴增
[0032]A、PCR反應引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/AAGGAGGTGATCCAGCCGC
[0033] B、在冰上建立PCR反應體系：
【主權項】
1. 一種羽毛降解細菌，其特征在于：該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis 1098-4,保藏號為 CGMCC No. 9844,其 16S rRNA 序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -種如權利要求1所述的羽毛降解細菌的應用，其特征在于：應用于降解羽毛，具 體工藝為：將枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis1098-4接種于發酵培養基，37°C，通氣量 3-5L/min，攪拌速度為120-600rpm，培養24-72小時，終止發酵，過濾或離心，得到羽毛降解 液。
3. 根據權利要求2所述的一種羽毛降解細菌的應用，其特征在于：所述發酵培養基為： 每IOOmL培養基中含葡萄糖lg、羽毛3.0g、NaCl0.0294g、磷酸氫二鈉0.4g、磷酸二氫鉀 0? 03g，pH7. 4-7. 8。
4. 根據權利要求2所述的一種羽毛降解細菌的應用，其特征在于：培養24-72h后，測 得角蛋白酶的最高酶活達30. 3U/mL。
【專利摘要】本發明涉及一種羽毛降解細菌及其應用，該菌株為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis1098-4，保藏號為CGMCC No.9844，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。應用于降解羽毛。本發明的菌株作用條件溫和，所產蛋白酶活性高，能夠在72-96小時內完全降解羽毛，產生可溶性蛋白及多種生物所需要氨基酸。CGMCC No.984420141027
【IPC分類】C12P21-06, C12N1-20, C12R1-125
【公開號】CN104694440
【申請號】CN201510131239
【發明人】曹張軍, 朱茜, 王娟, 楊雪霞, 楊光
【申請人】東華大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月24日