一株解鳥氨酸拉烏爾菌及其應用

一株解鳥氨酸拉烏爾菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物領域，涉及一種具有產電能力和能將巴卡亭III轉化生成 10-DAB的新菌株解鳥氨酸拉烏爾菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 1.產電微生物
[0003] 微生物燃料電池 （Microbial Fuel Cells, MFCs)是一種利用微生物做催化劑氧化 有機物并直接將化學能轉化成電能的新型裝置，它結合燃料電池與生物學技術手段，實現 了生物化學能與電能的直接轉化，是一種清潔的可持續能源，已逐漸成為新能源開發的焦 點。
[0004] 產電微生物（Electricigens)是指那些能夠在厭氧條件下完全氧化有機物，把氧 化有機物獲得的電子通過電子傳遞鏈傳遞到細胞外，直接或間接地通過介質（Mediator) 將電子傳遞到電極上產生電流的微生物，同時微生物在電子傳遞過程中獲得能量支持生 長。產電微生物作為微生物燃料電池中重要的生物催化劑，直接影響產電效率。因此挖掘 更多具有這種功能的微生物對于豐富產電微生物的多樣性，提高產電效率具有重要意義。
[0005] 目前已報道的能在無介體條件下運行MFCs產電的微生物包括細菌類和真菌 類。其中，細菌類產電微生物主要包括希瓦氏菌屬（Shewanella)、地桿菌屬（Geobacter)、 假單胞菌菌屬（Pseudomonas)、弓形菌屬（Arcobacter)、產氫細菌家族的產電菌（如丁 酸梭菌（Clostridium butyricum)、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、鐵還原紅 螺菌（Rhodoferax ferrireducens)、人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi)、耐寒細菌 (Geopsychrobacter electrodiphilus)、克雷伯氏月市炎菌（Klebsiella pneumoniae L17) 等。真菌類的產電微生物主要包括異常漢遜酵母（Hansenula anomala)、沼澤紅假單孢菌 (Rhodopseudomonas palustris)、小球藻（Chlorellavulgaris)等。但至今尚未發現拉烏 爾菌屬的菌株具有產電性能。
[0006] 2. IO-DAB 的制備
[0007]多烯紫杉醇是經結構修飾的紫杉烷類抗腫瘤藥物的典型代表，具有高效廣譜的抗 腫瘤活性，目前己經成為卵巢癌、乳腺癌等腫瘤治療的一線藥物。而IO-DAB是合成抗癌藥 物多烯紫杉醇的重要前體物質。
[0008] IO-DAB廣泛分布于紅豆杉植物的樹葉、根、皮、枝干中。傳統的提取方法需要多次 層析、梯度洗脫、多次重結晶后才能獲得精制品。這不僅造成IO-DAB的大量損失，降低了收 率，而且過程中還使用了大量易燃的石油醚和有毒性的乙腈，對環境造成不良影響。而利用 微生物轉化技術能將巴卡亭III轉化生成10-DAB，該過程具有專一性高，副產物生成少，反 應條件溫和、環境友好等優點。
[0009] 目前已報道的能以巴卡亭III為底物，轉化生成IO-DAB的微生物主要有：白色類 諾卡氏菌（Nocardioides albus)、黃色類諾卡氏菌（Nocardioides Iuteus)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、稻草假單胞菌（Pseudomonas straminea)、成團泛菌（Pantoea agglomerans)、紅球菌（Rhodococcus sp·)、莫拉氏菌（Moraxella sp.)等。至今尚未發現 拉烏爾菌屬的菌株具備將巴卡亭III轉化生成IO-DAB的能力。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的在于提供一株具有產電能力且能將巴卡亭III轉化生成10-DAB的 新菌株及研宄其在微生物燃料電池和制備10-DAB方面的應用。
[0011] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0012] -株解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19,菌株保藏編號： CGMCC No. 10267,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，地址： 中國北京市朝陽區北辰西路1號院，保藏日期：2014年12月30日。
[0013] 而且，所述菌株具有產電能力和將巴卡亭III轉化生成10-DAB的能力，
[0014] 而且，所述菌株應用于微生物燃料電池中表現出產電能力。
[0015] 而且，所述菌株含有或表達C-10脫乙酰基酶。
[0016] 一種具有產電能力和將巴卡亭III轉化生成10-DAB的菌株的篩選方法，步驟如 下：
[0017] ⑴富集
[0018] 待篩選污泥濃縮間的污泥經過簡單的淘洗和沉淀處理后，去掉底層無機化的沉淀 物和表層的清水，取中間含水率在95%左右的污泥作為接種物，和污泥營養液一起加入微 生物燃料電池的反應器中，連續運行10-20d，負載電阻兩端的電壓逐漸穩定，此時，陽極上 形成肉眼可見的厚的生物膜；
[0019] ⑵分離純化
[0020] 用接種環將生物膜上的全部菌體刮下，懸浮于無菌水中制備成均勻的菌懸液，涂 布在葡萄糖作為碳源的PBBM固體培養基上，30°C厭氧培養3-5d，將長出的具有不同形態的 單菌落分別挑出，在上述相同的培養基和培養條件下進行反復的劃線分離和純化培養，最 后得到多個純種的分離株，將其進行編號和命名；
[0021] ⑶篩選
[0022] ①將分離得到的菌株接種于陽極液I，得到的接種液注入微生物燃料電池的反應 器中，反應器與外電阻和數據采集裝置連接好，室溫下運行；
[0023] ②將收集得到的菌體經甲苯破碎處理后，投加底物巴卡亭III，37°C 200r/min轉 化3d，通過TLC、HPLC、LC-MS對轉化產物進行鑒定。
[0024] 權利要求1所述的解鳥氨酸拉烏爾菌P1-A-19用于微生物燃料電池中進行產電的 應用。
[0025] 解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19在制作微生物燃料電 池中的應用。
[0026] 解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica)P1-A-19 在制備 10-DAB 中的 應用。
[0027] 解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica)P1-A-19 制備 10-DAB 的方法， 將收集得到的菌株經甲苯破碎處理后，投加底物巴卡亭m，30-40°C，180-250r/min轉化 3-8d，獲得 10-DAB。
[0028] 本發明的優點和積極效果如下：
[0029] 本發明以在MFCs中具有產電能力作為初步篩選條件，以轉化巴卡亭III生 成10-DAB作為復篩條件，經這兩個步驟的嚴格限制，篩選獲得了一株菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19,經這兩步驟條件的嚴格限制篩選獲得具有產電性能和含C-IO 脫乙酰基酶的菌株，將菌株進行MFCs產電實驗和轉化巴卡亭III實驗，發現菌株能產生 132mV的電壓，且能將巴卡亭III轉化生成IO-DAB III。
[0030] 本發明對于豐富產電微生物的多樣性，挖掘更多具有高電化學活性的微生物菌種 具有重要意義；同時也進一步拓寬了用于10-DAB生物合成的微生物菌株，為開發新的紫杉 烷化合物的合成途徑提供了新材料和新方法。
【附圖說明】
[0031] 圖 1 為本發明菌株 Raoultella ornithinolytica P1-A-19 的菌落形態圖；
[0032] 圖2為本發明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19的革蘭氏染色結果；
[0033] 圖3為本發明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19的系統發育樹圖；
[0034] 圖 4 為本發明菌株 Raoultella ornithinolytica P1-A-19 應用于 MFCs 時的電 壓-時間曲線圖；
[0035] 圖 5 為本發明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19 轉化巴卡亭 III 的 TLC 結果，1 :巴卡亭III標準品（〇· 3mg/mL)，2 :10-DAB標準品（0· lmg/mL)，3 :菌體對照，4 :轉化 液樣品；
[0036] 圖 6為本發明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19轉化巴卡亭 III 的HPLC 結果，圖6A :巴卡亭III (0· 3mg/mL)和10-DAB(0. lmg/mL)的混合標準品，圖6B :轉化液樣 品；
[0037] 圖7為本發明菌株Raoultella ornithinolytica P1-A-19轉化巴卡亭III的轉 化產物的LC-MS圖，圖7A :T0F MS負離子掃描模式，圖7B :T0F MS正離子掃描模式。
【具體實施方式】
[0038] 下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。
[0039] 本發明的內容包括如下內容：
[0040] 一、通過將天津泰達污水處理廠污泥濃縮間的污泥置于單室型微生物燃料電池中 運行，以肉眼觀察到的陽極上富集的生物膜為研宄對象，利用可培養的方法分離純化得到 具有電化學活性的微生物純種。
[0041] 二、通過運行MFCs對分離株P1-A-19的產電性能進行分析。
[0042] 三、通過TLC、HPLC、LC-MS對分離株P1-A-19轉化巴卡亭III生成IO-DAB的能力 進行研宄。
[0043] 具體論述如下：
[0044] 一、菌株的分離篩選鑒定主要步驟如下：
[0045] (1)分離株的分離篩選
[0046] 待篩選污泥濃縮間的污泥經過簡單的淘洗和沉淀處理后，去掉底層無機化的沉淀 物和表層的清水，取中間含水率在95%左右的污泥作為接種物，和污泥營養液一起加入微 生物燃料電池的反應器中，連續運行10-20d，負載電阻兩端的電壓逐漸穩定，此時，陽極上 形成肉眼可見的厚的生物膜；
[0047] 用接種環將生物膜上的微生物刮下，懸浮于無菌水中制備成均勻的菌懸液，涂布 在葡萄糖作為碳源的PBBM固體培養基上，30°C厭氧培養3d，將長出的具有不同形態的單菌 落分別挑出，在相同的培養基和培養條件下進行三區劃線，30°C厭氧培養3d，經過多次分離 純化后得到純種的分離株，將其進行編號和命名。
[0048] (2)分離株P1-A-19的鑒定
[0049] 本發明的解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19具有如下的 形態和生理生化特性：
[0050] a.菌體的形態特征：革蘭氏陰性菌，桿狀；
[0051] b.菌落的形態特征：營養瓊脂平板上培養24h后，菌落形態為圓形、易挑取、不透 明、表面濕潤，邊緣整齊的白色菌落，直徑約1-1. 5mm ;
[0052] c.主要的生理生化特性引哚產生實驗和尿素酶實驗結果呈陽性，甲基紅實驗、 硫化氫實驗和氧化酶實驗呈陰性。
[0053] 上述結果表明，本發明的菌株P1-A-19的形態特征和生理生化特性均與文獻報道 的解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica) -致。
[0054] d.本發明的解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica)Pl-A_19分子分 類地位：
[0055] 采用Easypure? Genomic DNA kit試劑盒（北京天根生物科技有限公司）提 取菌株P1-A-19總DNA并以之為模板，對16S rDNA基因序列進行PCR擴增。引物對為通 用引物27F和1492R。PCR產物直接測序，測序結果提交NCBIGenBank(National Center ofBiotechnology Information)，用BLAST進行相似性檢索和同源性比較。利用MEGA5軟 件，運用Neighbor-Joining法，采用Kimura2_parameter校正模型，自舉1000次構建系統 發育樹。
[0056] 結果顯不，該菌株與 Raoultella ornithinolytica ATCC 318989 (NR 114502. 1) 的同源性最高，達到 99%，分離株 P1-A-19 與 Raoultella ornithinolytica ATCC31898 處 在系統發育樹的同一分支，親緣關系最為接近。
[0057] 綜合上述結果，本發明的菌株P1-A-19鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithin