D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法

專利名稱：D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法
技術領域：
本發明屬于手性化合物生物轉化分離技術領域，具體地說是涉及一種手性有機化合物的制備方法，尤其是制備D-鳥氨酸和腐胺的方法，也可適用于其它手 性D型氨基酸類化合物和脂肪胺或芳香胺的制備。
背景技術：
D型氨基酸具有重要的生理功能，隨著醫藥工業、食品工業及多肽合成科學 發展,對光學純氨基酸需求量急劇增加。但D-鳥氨酸(D-Ornithine, D-Orn)的 生產方法較少，生產成本較高。通過發酵法較難獲得D-鳥氨酸，而化學合成法 合成得到的氨基酸多為外消旋體(DL型)，必須進行拆分。使用脫羧酶進行DL-氨基酸酶法生物轉化是生產光學純D型氨基酸有效方法之一。鳥氨酸廣泛應用于醫藥、食品和農藥等領域。光學純鳥氨酸衍生物發展目標 是作為藥物或醫藥中間體。L-鳥氨酸(L-Ornithine, L-0rn)是一種重要氨基酸， 在醫藥、食品和飼料添加劑等方面具有廣泛用途。D-鳥氨酸屬于非天然氨基酸， 具有獨特的生物學特性，在多肽合成中具有重要作用。將多肽中某些L-氨基酸 以D-鳥氨酸取代，可以使該多肽產生特殊生物學性質，如D-鳥氨酸可以取代 腦啡肽的第二位氨基酸形成Tyr-D-Orn-Gly-Phe朋2這一類似物，其生理作用是 腦啡肽的數十倍。 一些氨基酸類抗生素中雜入D-鳥氨酸時，難以被細菌酶降解 而不至或減少抗藥性產生。D-鳥氨酸及其衍生物還可用于無公害新型氨基酸農藥 合成，應用前景十分廣闊。本發明還涉及到1，4-丁二胺(腐胺)及其衍生物制備。鳥氨酸脫羧基生成腐 胺(Putriscine， PUT)，后者再相繼轉變為精脒和精胺，這些統稱為多胺類化合 物。多胺是生物體內重要的代謝調控物質，是一種內源活性物質，廣泛存在于一 切生物體內，在生理pH下，多胺呈高密度的陽性電荷，參與核酸和蛋白質合成。 與正常細胞生長和分化以及與腫瘤發生和發展密切相關。如1948年Herbs首先 在細菌中發現多胺的存在，其后Ham和Bertossi分別于1964、 1965年發現多 胺在動植物細胞增殖中有重要作用。腐胺也能有效地保持植物愈傷組織的胚胎發 生能力，并減少愈傷組織的褐化。因此，腐胺、亞精胺和精胺等多胺在調節生長發育、細胞的增殖及分化等各個方面具有重要的意義。腐胺也可用于生產工程塑 料，尤其是聚酰胺-4，6的化合物現已成商品售出。目前，制備D-鳥氨酸和腐胺的方法，主要有化學合成法、手性拆分法、生物 發酵法等方法。1. D-鳥氨酸制備方法(1) 生物轉化方法通過DL-鳥氨酸與一氯乙酸的乙酰化作用，得到a， 5-二氯乙酰基-DL-鳥氨 酸，后使用從動物腎臟中提得乙酰化酶進行酶轉化使a ， S-二氯乙酰基-DL-鳥 氨酸中的a， S-二氯乙酰基-L-鳥氨酸中的氯乙酰基被降解，通過分離得到L-鳥氨酸和a， S-二氯乙酰基-D-鳥氨酸，而后再水解掉a ， 5-二氯乙酰基-D-鳥氨酸的氯乙酰基，得到D-鳥氨酸。(JBiolChem. 1951; 188(2):643-646)(2) 不對稱化學合成方法利用氨基保護的丙氨酸與苯甲醛二甲縮醛為反應原料經環化反應得到惡唑 烷酮，后分別與Y-碘代丁酸叔丁酯，疊氮基磷酸二苯酯(DPPA)反應，最后以 甲醇為溶劑經把催化加氫得到相應D-鳥氨酸衍生物。該方法雖然為不對稱合成方 法，但是反應步驟較長，所用試劑與原料較為難尋，且價格高昂，不利于D-鳥氨 酸的大規模制備。(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1995; 5(19): 2207-2210)2.腐胺制備方法合成腐胺已有大量合成路線，所有這些化學途徑有如下缺點起始材料從被 認為是不可更新的化工原料獲得，并將產生環境污染。制備腐胺經濟可行和環境 友好的方法是用可更新碳源以及使用活細胞的生物化學方法來合成腐胺。如利用 微生物發酵方法，以適當的碳源和氮源為發酵底物，將具有鳥氨酸脫羧酶活性的 微生物中產生的腐胺被排出到發酵培養液中，對發酵培養液中的腐胺進行收集 (CN101006183， 2005)。和通過對含有蛋白質作為主要的天然產品進行發酵生 產腐胺(EP0726240)。但是該兩種方法都存在不能制備D-鳥氨酸的缺點，同時通常多胺類物質被認 為對于生物化學生產中使用的任何細胞或微生物來說都是有毒的。因此，直到現 在，人們仍然詳細通過生物發酵的方法是不便獲得多胺類化合物。到目前為止，采用L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物為消旋反應原料， 經消旋反應得到DL-精氨酸或其衍生物，隨后以有賴氨酸脫羧酶或鳥氨酸脫羧酶 的微生物或酶進行生物轉化，得到D-鳥氨酸和腐胺及其衍生物的方法未見文獻 報道。本發明的目的是為克服上述現有技術的不足之處，提供一種生產成本較低、 后處理容易、設備投資少，環境友好且適合工業化生產D-鳥氮酸和腐胺及其衍 生物的方法，本發明是通過已發酵的全細胞所含的脫羧酶來進行酶催化反應不僅 獲得D-鳥氨酸，同時可獲得腐胺。本發明是以如下技術方案實現的D-鳥氨酸和腐胺及其衍生物手性制備方法 是以L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物為化學消旋反應原料，經消旋反應 得到DL-精氨酸或其衍生物，再用含有賴氨酸脫羧酶或鳥氨酸脫羧酶的微生物或 酶進行生物轉化，得到D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物，其方法步驟如下(1) 將L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物與適量催化劑水楊醛或其衍 生物混合后，在3(TC至溶劑沸點下溶于水的酸堿溶劑中，經0. 5-24小時反應后， 可得到DL-鳥氨酸或其衍生物；(2) 取上述DL-鳥氨酸或其衍生物，用經發酵培養的微生物含有脫羧酶全 細胞或提取得到相應脫羧酶，再加入PH5-10緩沖溶液和表面活性劑，將該DL-鳥氨酸或其衍生物中的丄-鳥氨酸或其衍生物脫羧分解，可得到D-鳥氨酸和腐胺 或其衍生物；(3) 通過等電點結晶法或等電點結晶法與離子交換樹脂分離相結合的方法 將反應生成物進行分離，得到高純度的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物。上述步驟(1)所述的L-精氮酸或部分消旋精氨酸及其衍生物其結構式是其中Ri可以是烷基、芳基、鹵素、羥基和烷氧基取代基；，R2可以是烷基、 芳基、卣素、羥基和烷氧基取代基；R3可以是烷基、芳基、鹵素、羥基和烷氧基發明內容取代基。所述的L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物也可以是精氨酸鹽包括 鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。 上述步驟(2)所述的脫羧酶為(1) L-賴氨酸脫羧酶(L-Lysine Decarboxylase, EC 4.1.1.18， LDC)，催 化以下反應DL-鳥氨酸 D-鳥氨酸 腐胺(2) L-鳥氨酸脫羧酶(L-Ornithine Decarboxylase, EC4. 1. 1. 17，簡稱 ODC)，催化以下反應上述步驟(2)所用的培養基碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，果 糖，乳糖。其濃度為5-30g/L;氮源采用有機氮源，如酵母膏，玉米漿，蛋白胨， 豆餅水解液或蛋白質水解物，其濃度為5-30g/L，加入L-賴氨酸或L-鳥氨酸誘 導，其濃度為0. 1-20g/L。上述步驟(2)所述的緩沖溶液包括磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液，磷酸鹽 緩沖溶液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液，巴比妥鈉-鹽酸緩沖溶液，Tis-鹽酸 緩沖溶液硼砂-鹽酸緩沖溶液，硼酸-硼砂緩沖溶液，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液，碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖溶液使轉化液pH5-10。上述步驟(2)所述的表面活性劑包括吐溫-80，十六烷基三甲基溴化銨，聚 乙二醇辛基苯基醚，其濃度為0. 005%-5%。上述步驟(2)所述的培養液中賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶為每小時每克 濕細胞轉化lX103 lX105nmol L-鳥氨酸。本發明的優點是D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法是一種既經濟可 行又具有高效拆分效率的適合工業化生產的方法，從目前的研究表明，采用L-精氨酸或部分消旋精氨酸及其衍生物為化學消旋反應原料,經消旋反應得到D,L-精氨酸或其鹽及其衍生物，隨后以有賴氨酸脫羧酶或鳥氨酸脫羧酶的微生物或酶 進行生物轉化，得到D-鳥氨酸和腐胺及其衍生物的方法是經濟可行的，適合于 大規模工業化生產且具有環境友好特點。本發明解決了 D-鳥氨酸和腐胺或其衍 生物制備中的以下幾個問題(1) 使用溶劑無毒害、價格低廉，而且易于回收。a. 本發明減少了貴重有機溶劑的使用，所使用的溶劑為無毒無害的親水性 溶劑體系，而且價格低廉，方便獲得，易于回收。b. 通過拆分母液的循環使用，減少了溶劑的使用量，降低了生產成本。(2) 原料來源廣泛，價格便宜。利用L-精氨酸或部分消旋精氯酸為消旋反應原料，具有原料來源廣，價格低 廉的優勢，隨著我國氨基酸發酵工業的發展，精氨酸面臨產能過剩問題，本方法 需找到一種以精氨酸為原料制備高附加值的D-鳥氨酸和腐胺及其衍生物的方 法，有助于解決這一矛盾。(3) 、該方法具有轉化時間短，操作簡便，生產成本低等優點，同時工藝流 程簡單，適合于工業化生產。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明 實施例11.將泡/)w'a AS 1. 1009菌株在如下1000mL培養基中蔗糖2%，蛋白胨1%，玉米漿2%，酵母膏0. 1%， (NH4) 2S04 0. 1%， L-賴氨酸1%。發酵條件為 溫度35°C ，接種量6% ，培養基裝量100mL，發酵時間14h。經4000rpm離心15rain得濕細胞。2. 將細胞加入到600mL轉化液中，轉化液含有10%的經消旋反應得到的DL-鳥氨酸，加入6mL0. 5%吐溫-80和600mL pH8. 0磷酸緩沖液，37。C反應24h。。3. 將轉化液濃縮至200mL，加入2g活性炭脫色處理。脫色液繼續濃縮至 100mL，加入200mL95y。乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，過濾后真空干燥得到晶體干重37.5g， [a]1)U=-11.5(C=5.5, H20)，所得母液經JK008陽離子樹脂吸附，用3%氨水洗脫，洗脫液經活性炭脫色后濃縮，將濃縮液調pH至lO，得到腐胺21.8g。 轉化后可以得到理論收率為75. 0%的D-鳥氨酸和理論收率為65. 3%的腐胺。 實施例21. 選用#3/>w's sJrei AS 1.1009菌株，種子培養和發酵條件同實施例1， 得濕細胞。2. 將細胞加入到600mL轉化液中，轉化液含有10%的經消旋反應得到的DL-鳥氨酸，加入6mL 0. 1%十六烷基三甲基溴化銨和600mL pH7. 0磷酸二氫鈉-檸檬 酸緩沖溶液，3(TC反應36h。3. 將轉化液濃縮至200mL，加入2g活性炭脫色處理。脫色液繼續濃縮至 100mL，加入200mL95y。乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，過濾后真空干燥得到晶體干重30. lg， [ a ]ZDU=-10.8(05.5， H20),所得母液經JK008陽離子樹脂吸附，用3% 氨水洗脫，洗脫液經活性炭脫色后濃縮，將濃縮液調PH至IO，得到腐胺。轉化 后可以得到理論收率為60. 2%的D-鳥氨酸和理論收率為51. 2%的腐胺。 實施例31. 將^s/) /s W陀i AS 1. 1009菌株在如下1000raL培養基中葡萄糖2%， 豆餅水解液1%，玉米漿2%，酵母膏0. 1%， (NH4) 2S04 0. 1%， L-鳥氨酸0. 5%。發 酵條件為溫度35°C，接種量5%，培養基裝量100mL，發酵時間20h。經4000rpm 離心15min得濕細胞。2. 將細胞加入到600raL轉化液中，轉化液含有10%的經消旋反應得到的DL-鳥氨酸，加入6mL0. 5%吐溫-80和600mLpH9. 0硼砂-鹽酸緩沖溶液，4(TC反應站h。3. 將轉化液濃縮至200mL，加入2g活性炭脫色處理。脫色液繼續濃縮至 100mL，加入200mL95。/。乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，過濾后真空干燥得到晶體干重35.5g， [a]l)U=-11.2(C=5.5， H20)，所得母液經JK008陽離子樹脂吸附，用3%氨水洗脫，洗脫液經活性炭脫色后濃縮，將濃縮液調pH至lO，得到腐胺20.3g。 轉化后可以得到理論收率為71. 0%的D-鳥氨酸和理論收率為60. 7%的腐胺。
權利要求
1.一種D-鳥氨酸和腐胺及其衍生物手性制備方法，其特征在于以L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物為化學消旋反應原料，經消旋反應得到DL-精氨酸或其衍生物，再用含有賴氨酸脫羧酶或鳥氨酸脫羧酶的微生物或酶進行生物轉化，得到D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物，其方法步驟如下(1)將L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物與適量催化劑水楊醛或其衍生物混合后，在30℃至溶劑沸點下溶于水的酸堿溶劑中，經0.5-24小時反應后，可得到DL-鳥氨酸或其衍生物；(2)取上述DL-鳥氨酸或其衍生物，用經發酵培養的微生物含有脫羧酶全細胞或提取得到相應脫羧酶，再加入pH5-10緩沖溶液和表面活性劑，將該DL-鳥氨酸或其衍生物中的L-鳥氨酸或其衍生物脫羧分解，可得到D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物；(3)通過等電點結晶法或等電點結晶法與離子交換樹脂分離相結合的方法將反應生成物進行分離，得到高純度的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物。
2. 根據權利要求1所述的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法，其特征在于步驟(1)所述的L-精氨酸或部分消旋精氨酸及其衍生物其結構式是<formula>formula see original document page 2</formula>其中R'可以是烷基、芳基、鹵素、羥基和烷氧基取代基；R2可以是烷基、芳 基、鹵素、羥基和烷氧基取代基；R3可以是垸基、芳基、鹵素、羥基和垸氧 基取代基，所述的L-精氨酸或部分消旋精氨酸或其衍生物也可以是精氨酸鹽 包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。
3.根據權利要求1所述的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法，其特征在于步驟(2)所述的脫羧酶為(1) L-賴氨酸脫羧酶(L-Lysine Decarboxylase, EC 4.1.1.18， LDC)， 催化以下反應(2) L-鳥氨酸脫羧酶(L-Ornithine Decarboxylase, EC4丄1. 17，簡稱 ODC)，催化以下反應<formula>formula see original document page 3</formula>
4. 根據權利要求1所述的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法，其特征在于步驟(2)所用的培養基碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，果糖，乳糖，其濃度為5-30g/L;氮源采用有機氮源，如酵母膏，玉米漿， 蛋白胨，豆餅水解液或蛋白質水解物，其濃度為5-30g/L，加入L-賴氨酸或 L-鳥氨酸誘導，其濃度為0. 1-20g/L。
5. 根據權利要求1所述的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法，其 特征在于步驟(2)所述的緩沖溶液包括磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液， 磷酸鹽緩沖溶液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖溶液，巴比妥鈉-鹽酸緩沖溶液， Tis-鹽酸緩沖溶液硼砂-鹽酸緩沖溶液，硼酸-硼砂緩沖溶液，甘氨酸-氫氧化 鈉緩沖溶液，碳酸氫鈉-氫氧化鈉緩沖溶液使轉化液pH5-10。
6. 根據權利要求1所述的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法，其 特征在于步驟(2)所述的表面活性劑包括吐溫-80，十六烷基三甲基溴化 銨，聚乙二醇辛基苯基醚，其濃度為0. 005%-5%。
7. 根據權利要求1所述的D-鳥氨酸和腐胺或其衍生物手性制備方法，其 特征在于步驟(2)所述的培養液中賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶為每小時 每克濕細胞轉化lX103 lX105ymol L-鳥氨酸。
全文摘要
本發明屬于手性化合物生物轉化分離技術領域，具體地說是涉及一種手性有機化合物的制備方法，尤其是制備D-鳥氨酸和腐胺的方法，也可適用于其它手性D型氨基酸類化合物和脂肪胺的制備。將L-精氨酸或其鹽與水楊醛或其衍生物按比例混合，溶于堿性或酸性溶劑中，經消旋反應后，得到DL-鳥氨酸；取DL-鳥氨酸，在25℃至45℃下用含有賴氨酸脫羧酶或鳥氨酸脫羧酶的微生物或酶進行生物轉化，得到D-鳥氨酸和腐胺，再用等電點結晶法或離子交換樹脂分離方法，將D-鳥氨酸和腐胺分離，得到光學純D-鳥氨酸和腐胺。本方法使用的化學消旋方法主要有水為溶劑，催化劑消耗少，使用的溶劑無毒害、價格低廉，微生物易于培養，適合于大規模工業化生產。
文檔編號C12P41/00GK101235403SQ200810018589
公開日2008年8月6日 申請日期2008年2月26日 優先權日2008年2月26日
發明者毅 劉, 玲 劉, 莉 劉, 印曉星, 玲 張, 林奇泗 申請人:徐州醫學院