一種海甘藍種間雜種基因組原位雜交的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于作物分子育種技術領域，具體涉及一種海甘藍種間雜種基因組原位雜 交的方法，與作物育種領域有關。
【背景技術】
[0002]基因組原位雜交技術（Genomic in situ hybridization, GISH)是在 20 世紀80 年 代末發展起來的分子細胞遺傳技術。它采用來自一個物種的總基因組DNA作為標記探針， 用另一物種的總基因組DNA以適當的濃度進行封阻，在靶染色體上進行原位雜交。在封阻 DNA和標記DNA探針之間，封阻DNA優先與一般序列雜交，剩下的特異性序列主要被標記探 針所雜交。
[0003] 在生物的原位雜交技術方面已檢索到相關的文獻，例如文獻-1，公開號為 CN104099416A公開了"一種芝麻染色體熒光原位雜交方法"，其要點是，采用涂片技術制作 芝麻中期染色體標本，采用熒光素標記BAC標本進行芝麻BAC的染色體原位雜交，探針雜 交染色體后，檢測熒光信號，從而確定目的DNA片段在染色體上的拷貝數量及位置，其缺點 是：該專利申請與本發明相比不屬于同一個反應體系，且物種的基因型也是不相同的。
[0004] 文獻-2即公開號為CN102605051A公開了 "一種EAAT2基因cRNA原位雜交探針及 其設計方法"，其要點是，根據EAAT2基因的序列設計引物，擴增適當長度的該基因的片段作 為該基因的探針質粒，以該探針質粒轉化細菌后進行測序，制備得到該基因的cRNA雜交探 針，進一步檢測該基因片段cRNA探針的原位雜交信號。該專利申請的的目的是應用于細菌 方面，與本發明有本質的區別。
[0005] 文獻_3,即公開號為CN103320505A公開了"一種HSD11B1基因的原位雜交的探針 制定及檢測方法"，采用了與文獻-2相同的方法，區別在于合成了 HSD11B1基因的mRNA原 位雜交探針序列，并在其探針標記上標記了"地高辛"，主要用于該HSD11B1基因原位雜交 檢測，屬于生物病理領域，與本發明有本質的差異。
[0006] 文獻-4即公開號為CN103451287A公開了 "一種改良共變性熒光原位雜交方法"， 其步驟包括：制備玻片標本、探針與染色體共變性和雜交，雜交后洗滌并做染色和信號檢 測，該發明的探針為商購探針，作用對象是羊水、絨毛或血液，屬于臨床醫學領域，與本發明 的領域有本質的區別。
[0007] 本發明涉及的作物是海甘藍（Crambe)屬于十字花科海甘藍屬植物，種子合油量 為34. 48%，其中芥酸含量為55% -62. 50%。海甘藍的種子油通常在工業上有廣泛的應用。 可以通過遠緣雜交技術將其培育成為新型工業油料作物。
[0008] 迄今為止尚未見到有關海甘藍種間雜種基因組原位雜交方法的應用及報道。
【發明內容】
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[0009] 本發明的目的是提供一種檢測海甘藍種間雜種的染色體原位雜交方法以應用于 海甘藍種間雜種鑒定以及基因組親緣關系研宄，以便為作物育種特別是為作物的分子育種 提供技術基礎。
[0010] 本發明總體技術方案包括探針的標記、原位雜交制片、原位雜交和信號檢測等四 個步驟。
[0011] 本發明建立的雜交方法，光信號強，易于檢測。雜交獲得的染色體形態完好，能夠 有效的用于海甘藍染色體的鑒定和結構的研宄。
[0012] 本發明的具體技術方案如下所述：
[0013] 1、探針標記的制備
[0014] 探針標記的制備：提取海甘藍Crambe kraliiki (母本）基因組DNA進行探針標 記，標記方法為將所得的海甘藍基因組DNA(提取海甘藍基因組的方法為常規CTAB法）采 用切口平移法，用Bio-11-dUTP標記（一種分子試劑，購自上海生工生物工程有限公司），其 標記體系為：
【主權項】
1. 一種海甘藍種間雜種基因組原位雜交的方法，其特征在于，包括下列步驟： (1) 探針標記體系的建立及封阻DNA制備 1) 探針的標記體系 利用CTAB法提取母本海甘藍（Crambe kralikii)葉片的基因組DNA，采用切口平移法 用Bio-11-dUTP對提取的母本海甘藍基因組DNA進行標記，所述的標記體系為：
在200 μ 1的離心管中依次加入上述各組分，充分混勻并離心，然后將其置于15°C中水 浴2. 5h ;標記結束后用1%的瓊脂糖凝膠檢測片段大小，如片段大小為200-500bp時，加入 濃度為〇. 5M的5 μ I EDTA，終止反應，置于-20°C保存備用； 2) 封阻DNA制備： 利用CTAB法提取父本海甘藍（Crambe abyssinica)葉片基因組DNA用作封阻DNA，處 理方式為將該基因組DNA在沸水中處理40min，使其DNA片段的長度與探針長度同為300 - 500bp ； (2) 原位雜交制片 1) 載玻片的準備 將新的玻片放入80%濃硫酸配制的鉻酸溶液中，室溫下放置IOh以上，撈出后用自來 水洗掉鉻酸，仔細清洗每張玻片；然后將清洗好的片子放置于流水中沖洗至少lOmin，再用 蒸餾水沖洗一次，用100%乙醇浸泡備用； 2) 酶解花藥 將固定好的海甘藍花藥放入檸檬酸緩沖液中，置搖床上搖動20min，放入酶的混合液 中，所述酶的成分和濃度為〇. 6%纖維素酶，0. 2%的果膠酶和0. 1 %的蝸牛酶；于37°C下水 浴 45-52min ; 3) 制片 將酶解好的海甘藍花藥用吸管輕輕移入檸檬酸緩沖液中漂洗20min，用吸管將所述的 花藥材料移到預先晾干的載玻片上，并加一滴檸檬酸緩沖液，在解剖境下仔細解剖海甘藍 的花藥，去掉雜質，在滴液干之前加5-10μ1的45%乙酸；放置Imin后，用移液器滴加一至 數滴的冷的卡諾固定液展片，待卡諾固定液干后在相差顯微鏡下檢查制片的質量；選擇質 量好的制片于-20°C下保存備用； (3) 原位雜交 將準備原位雜交的制片在37°C的烘箱中烘至12h ; 1) 蛋白酶的處理 準備一個能夠同時放置幾張玻片的塑料盒子，底部放一張濾紙，用20 X SSC潤濕，置于 37°C烘箱中預熱，每片加濃度為8 μ g/mL的蛋白酶K150 μ 1，蓋上耐高溫的塑料軟膜，將載 玻片平穩的置于濕盒內，蓋上蓋子后于37°C烘箱中溫育30min ; 2. RNA酶處理 將載玻片從濕盒中拿出，放入盛有70ml的2X SSC的玻片缸中，待軟膜飄起后將其撈 出，將玻片缸置于平板搖床上輕搖5min ;每片加濃度為150 μ 1的RNA酶液100 μ g/ml，使用 前用2 X SSC稀釋，蓋膜，在濕盒中37°C溫育Ih ; 3) 多聚甲醛的處理 在RNA酶處理的同時，配制4%的多聚甲醛溶液，加入14ml的0.1 M的NaOH溶液，搖動 三角瓶直到溶液變澄清，補充蒸餾水至70ml，搖勻冷卻后倒入玻片缸中，置通風櫥中備用； 將經過RNA酶處理好的制片放入玻片缸中用2 X SSC在搖床上漂洗三次，每次4min ;放入多 聚甲醛溶液中，搖床上搖動15min ;再用2X SSC漂洗三次；制片分別在70%、100%的乙醇 中脫水5min ;空氣中干燥； 4) 雜交混合液的制備 在I. 5ml的離心管中按每張制片的量依次加入以下試劑或組分： 100 %的甲酰胺 25μ1 20. S SC 5μ1 SS 1)ΝΛ 0.5μΙ 50 °/。硫酸葡聚糖 10μ1 混勻，離心后加入 Bio-11-dUTP 探針 5 μ 1(總量 Iyg) 10倍于探針量的封阻DNA 5 μ 1(總量IOyg) 總體積 50 μ 1 將雜交混合液混勻，離心，70°C水浴變性lOmin，冰上冷卻5min，每片加50 μ 1雜交混合 液，蓋膜，在原位PCR儀上80°C下共變性處理5min，于37°C濕盒中溫育過夜； 5) 雜交后的洗脫 a) 用0.1 XSSC配制20%的甲酰胺溶液，42°C水浴預熱，同時預熱兩份2X SSC溶液； b) 將玻片放入盛有2XSSC的玻片缸中，待塑料膜飄起后撈出； c) 將玻片轉入預熱的甲酰胺中，42°C水浴IOmin ; d) 將玻片轉入預熱的2X SSC中兩次，每次5min ; e) 在室溫下，用2XSSC漂洗玻片一次，5min ; 6) 生物素檢測 a) 用I X磷酸鹽緩沖液即PBS將玻片漂洗一次，5min ; b) 5%的牛血清白蛋白（BSA) 100 μ 1/每片，室溫放置5min，揭膜； c) 用％牛血清白蛋白與熒光素 Cy3按1 :40的體積比配制Cy3溶液，然后每一玻片上 加50ul上述配制好的Cy3溶液，最后蓋膜； d) 在濕盒中37°C溫育30min ; e)用I X PBS洗三次，每次5min ; 7. DAPI負染與封片 a) 向每一玻片上滴加濃度為5 μ g/ml的DAPI 100 μ 1 ; b) 將玻片蓋膜后在室溫下放置15min ; c) 將玻片放入IXPBS中待膜飄起后拿出； d) 每一玻片加抗熒光猝滅劑一滴； e) 將上步的玻片在4°C下避光保存； (4)對雜交信號進行檢測。
2.如權利要求1所述的一種海甘藍種間雜種基因組原位雜交的方法，其特征在于，提 取海甘藍（Crambe abyssinica)基因組DNA的材料包括花藥、子房或植株幼嫩葉片。
【專利摘要】本發明屬于作物分子育種技術領域，具體涉及一種海甘藍種間雜種基因組原位雜交的方法，本發明步驟包括制備探針標記、制片、原位雜交和信號檢測等。在制片過程中通過采用合適的酶解條件及醋酸延展火焰干燥法可以得到形態好、分散性好的海甘藍減數分裂期的染色體制片。在探針和染色體變性時選擇合適的溫度和時間，并確定了合適的封阻DNA和探針濃度比，獲得了信號清晰的熒光原位雜交圖片，能夠清楚的鑒定海甘藍雜種中來自于不同種間的染色體，使得基因組原位雜交可以較好的應用于具有染色體數目多、形態小等特點的海甘藍物種的細胞學檢測，為海甘藍染色體鑒定和結構研究、海甘藍的進化研究等提供了新的技術和途徑。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104745695
【申請號】CN201510125803
【發明人】杜雪竹, 黃邦全, 黃邦連, 李再云
【申請人】湖北大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月23日