一種牡丹基因組dna分子標記方法
【專利摘要】一種牡丹基因組DNA分子標記方法，提取牡丹基因組DNA進行酶切，將酶切產物和接頭DNA連接；將連接產物與預擴增引物進行PCR擴增，得到預擴增產物；取所得到預擴增產物與用內切酶接頭選擇性擴增引物iPBS引物進行PCR擴增，得PCR選擇性擴增產物；然后取PCR選擇性擴增產物，加入染色液并點樣進行電泳，電泳完成后，銀染，觀察、拍照，分析結果。本發明是建立在PCR與酶切基礎上的分子標記技術，操作簡單；成本低，適用性強；針對牡丹基因組研究技術而設計，開發了一種新的基于反轉錄轉座子的分子標記體系，為牡丹的種質資源遺傳變異和進化研究提供新的技術手段。
【專利說明】一種牡丹基因組DNA分子標記方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分子標記法，具體的說是一種牡丹基因組DNA分子標記方法。
【背景技術】
[0002]牡丹SuffruticosaAndr.)為茍藥科(Paeoniaceae)茍藥屬
L.)牡丹組(Sect.Mouton DC.)落葉灌木，是重要的觀賞綠化植物和資源植物，其花大形美、色艷香濃，為歷代人們所稱頌，是我國著名的傳統名花，在中國已有2000余年的栽培應用歷史。我國牡丹在長期的栽培馴化過程中，形成了以中原、西北、江南和西南等品種群為代表的，具有不同花瓣顏色、數目、花型和葉型的栽培品種1000多個，栽培區域遍及全國各地。牡丹組共有9個種，(洪德元和潘開玉，1999 ；Hong和Pan, 2007),分布于河南、甘肅、陜西、山西、安徽、湖北、四川、云南和西藏等9個省區。
[0003]其它作物上的研究表明反轉錄轉座子與基因組的進化，性狀的變異等密切相關。已有研究表明反轉錄轉座子是植物基因組進化的主要動力，借助于反轉錄轉座子可以準確獲得種質間的進化關系。牡丹種質資源遺傳多樣性豐富，遺傳變異大，但對于種質間的進化關系還未了解清楚。
[0004]分子標記技術可從DNA水平上檢測生物體的遺傳多樣性，不受基因表達和環境條件的影響，其操作簡單快速，易實現自動化，廣泛應用于植物遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標記輔助育種等方面。目前應用較多的分子標記技術主要有RAPD、SSR、ISSR、AFLP, SRAP等。反轉錄轉座子分子標記較傳統的分子標記具有諸多優勢，其檢測的多態性信息含量明顯高于傳統分子標記。近年來，隨著研究的逐漸深入，基于反轉錄轉座子的分子標記方法也在增加，其中最常用的主要是SSAP、IRAP、REMAP、RBIP四種，已廣泛用于植物種質資源及遺傳育種 研究。基于反轉錄轉座子的分子標記與常規分子標記技術比較，反轉錄轉座子最大的優勢在于它能覆蓋全基因組，提供的信息更豐富，可作為高通量標記分析，具有很大的發展潛力。與RFLP、RAPD, SSR和AFLP等常規DNA標記檢測多態性不同，基于反轉錄轉座子的標記技術的多態性來源于其結構、組成、分布和逆轉座的生物學過程。
[0005]反轉錄轉座子分子標記是目前應用廣泛的分子標記技術，已被應用于大麥、玉米、小麥、蘋果、葡萄等多種植物。利用反轉錄轉座子分子標記不僅可以有效地進行體細胞克隆變異的鑒定，還可以有效地進行遺傳作圖和農藝性狀基因的標記，用于生物多樣性和系統進化關系分析。其中，SSAP (Sequence-specific amplification polymorphism)是一種可以檢測反轉錄轉座子和與其鄰近的酶切位點之間DNA片段擴增多態性的反轉錄轉座子分子標記。其原理和操作流程類似于AFLP，只是在進行選擇性擴增時除了一個能與接頭同源配對的引物外，另一個引物根據反轉錄轉座子的LTR (長末端重復序列)末端保守序列來設計。SSAP由限制性內切酶消化基因組DNA，然后連接接頭，再分別進行預擴增和選擇性擴增，通過同一位置片段的有無來判斷其多態性。多態性來源于限制性位點及其兩側序列的變異，這點與AFLP相同，而LTR5’末端和反轉錄轉座子插入位點的變異所產生的多態性是AFLP所沒有的，因此SSAP標記方法不僅可以檢測插入位點的多態性，又可識別反轉錄轉座子內部變異，但其實施是建立在反轉錄轉座子兩端LTR序列分離的基礎上。若想開展此類標記，必須先得到反轉錄轉座子LTR序列，而目前分離LTR序列方法的效率還較低。
【發明內容】
[0006]本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其為牡丹的種質資源遺傳變異和進化研究提供新的技術手段而且更加簡單、高效，實用，大大簡化了試驗程序，大大的降低了應用難度。
[0007]本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案是:一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為:
步驟一、提取牡丹基因組DNA ；
步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:用限制性內切酶Mse I和限制性內切酶EcoR I對上述步驟一所提取的基因組DNA進行酶切，得到基因組DNA酶切產物；
所述基因組DNA酶切的酶切體系為20 μ L，包括濃度為50ng/ μ L基因組DNA5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液4 2.0 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白OJyUMse I酶0.5 μ L，EcoR I酶0.5 μ L，余量為雙蒸水。
[0008]步驟三、酶切產物和接頭DNA連接:將所得基因組DNA酶切產物、Mse I接頭引物、EcoR I接頭引物、Τ4 DNA連接酶和稀釋10倍后的連接緩沖液混合均勻后在溫度為16°C的條件下保溫30min，得到 連接產物；
所述的Mse I接頭引物序列包括Mse I 5’端接頭引物和Mse I 3’端接頭引物，其堿基序列如序列表序列I和序列2 ;所述的EcoR I接頭引物序列包括EcoR I 5’端接頭引物和EcoR I 3’端接頭引物，其堿基序列如序列表序列3和序列4 ；
所述連接的具體操作方法為，在微量PCR離心管中，加入基因組DNA酶切產物8 μ L，MseI接頭引物2.5yL、EcoR I接頭引物2.5 μ L、T4 DNA連接酶I μ L、稀釋10倍后的連接緩沖液2.5 μ L，之后用雙蒸水補齊至25 μ L ;用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下保溫30min，得到連接產物。
[0009]步驟四、連接產物的預擴增:
(1)、取上述步驟三所得部分連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20 μ mo I/L的Mse I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到Mse I預擴增產物；
(2)、取上述步驟三所得剩余連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20 μ mo I/L的EcoR I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到EcoR I預擴增產物；
所述的Mse I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列5;所述EcoR I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列6 ；
所述連接產物的預擴增更具體的操作方法為在微量PCR離心管中，加入連接產物
2.5 μ L，稀釋 10 倍后的緩沖液 2.5 μ L，含 Mg2+ 的溶液 1.875 μ L、dNTPs 0.5 μ L、Mse I 預擴增引物0.5 μ L、EcoR I預擴增引物0.5 μ L、Taq酶0.2 μ L，之后用雙蒸水補齊至25 μ L，置于PCR儀中，進行PCR預擴增。[0010]步驟五、選擇性擴增:取上述步驟四得到的Mse I預擴增產物和EcoR I預擴增產物，分別用雙蒸水稀釋20-40倍后，將其與用雙蒸水稀釋至20 μ mol/L的內切酶接頭選擇性擴增引物、用雙蒸水稀釋至20 μ mol/L的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀釋10倍后的緩沖液和雙蒸水混合均勻后，進行PCR擴增，得PCR選擇性擴增產物；
所述內切酶接頭選擇性擴增引物為堿基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I選擇性擴增引物中的任意一條，或者堿基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I選擇性擴增引物中的任意一條；
所述的iPBS引物為喊基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一條；所述步驟五的操作方法為:在微量PCR離心管中，加入稀釋到20 μ mol/L的內切酶接頭選擇性擴增引物5~10 μ 1，稀釋到20 μ mol/L的iPBS引物5~10 μ 1，稀釋10倍后的Buffer2.5μ 1，含 Mg2+的溶液，的 L 875 μ 1，dNTP 0.5 μ I,Mse I 預擴增產物 0.5 μ l、EcoRI預擴增產物0.5μ l，Taq酶0.2μ 1，余量用雙蒸水補齊至25μ 1，置于PCR儀中，進行PCR選擇性擴增。所述PCR選擇性擴增，具體PCR程序為94°C 5min ；94°C 30s,68°C 30s _0.7°C循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 個循環；72°C 5min。
[0011]步驟六、首先制備6.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，取PCR選擇性擴增產物，加入染色液并點樣進行電泳，電泳完成后，銀染，觀察、拍照，分析結果。
[0012]有益效果是:
1、本發明是建立在PCR與酶切基礎上的分子標記技術，操作簡單；成本低，適用性強；針對牡丹基因組研究技術而設計，開發了一種新的基于反轉錄轉座子的分子標記體系，為牡丹的種質資源遺傳變異和進化研究提供新的技術手段；整個分子標記開發思路上不囿于現有SSAP標記必須基于LTR特異引物的限制，大膽利用iPBS引物替代SSAP分子標記中的LTR特異引物，使該方法不需要費時費力地開發`引物，大大的降低了技術的應用難度；在牡丹上的應用表明，效果較好，具有較好的應用前景。
[0013]2、本發明有效結合了 iPBS標記方法和SSAP標記方法的優勢，與SSAP標記相比，本發明方法不用開發特異的LTR引物，大大的降低了應用難度；與iPBS標記相比，本發明方法因為還擴增了反轉錄轉座子與酶切位點區間，多態性大大增強。針對SSAP標記方法中LTR特異引物分離困難，利用iPBS引物替代該特異引物，不僅可以直接用于種質資源多態性研究，而且更加簡單、高效，實用。本發明方法具有通用性，引物可以在物種間通用，可大大減少了開發特異引物的費用，多態性強，方法具有通用性，引物可以在物種間通用，具有廣闊簡單應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明的實施例1聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖；
圖2為本發明的實施例2聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖；
圖3為本發明的實施例3聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖；
圖4為本發明的實施例4聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖；
圖中標記是:1、M為marker。
【具體實施方式】[0015]一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為:
步驟一、提取牡丹基因組DNA ；
步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:用限制性內切酶Mse I和限制性內切酶EcoR I對上述步驟一所提取的基因組DNA進行酶切，得到基因組DNA酶切產物；
所述基因組DNA酶切的酶切體系為20 μ L，包括濃度為50ng/ μ L基因組DNA5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液4 2.0 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白OJyUMse I酶0.5 μ L，EcoR I酶0.5 μ L，余量為雙蒸水。
[0016]步驟三、酶切產物和接頭DNA連接:將所得基因組DNA酶切產物、Mse I接頭引物、EcoR I接頭引物、Τ4 DNA連接酶和稀釋10倍后的連接緩沖液混合均勻后在溫度為16°C的條件下保溫30min，得到連接產物；
所述的Mse I接頭引物序列包括Mse I 5’端接頭引物和Mse I 3’端接頭引物，其堿基序列如序列表序列I和序列2;所述的EcoR I接頭引物序列包括EcoR I 5’端接頭引物和EcoR I 3’端接頭引物，其堿基序列如序列表序列3和序列4 ；
所述連接的具體操作方法為，在微量PCR離心管中，加入基因組DNA酶切產物8 μ L，MseI接頭引物2.5yL、EcoR I接頭 引物2.5 μ L、T4 DNA連接酶I μ L、稀釋10倍后的連接緩沖液2.5 μ L，之后用雙蒸水補齊至25 μ L ;用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下保溫30min，得到連接產物。
[0017]步驟四、連接產物的預擴增:
(1)、取上述步驟三所得部分連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20 μ mo I/L的Mse I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到Mse I預擴增產物；
(2)、取上述步驟三所得剩余連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20 μ mo I/L的EcoR I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到EcoR I預擴增產物；
所述的Mse I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列5;所述EcoR I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列6 ；
所述連接產物的預擴增更具體的操作方法為在微量PCR離心管中，加入連接產物
2.5 μ L，稀釋 10 倍后的緩沖液 2.5 μ L，含 Mg2+ 的溶液 1.875 μ L、dNTPs 0.5 μ L、Mse I 預擴增引物0.5 μ L、EcoR I預擴增引物0.5 μ L、Taq酶0.2 μ L，之后用雙蒸水補齊至25 μ L，置于PCR儀中，進行PCR預擴增。
[0018]步驟五、選擇性擴增:取上述步驟四得到的Mse I預擴增產物和EcoR I預擴增產物，分別用雙蒸水稀釋20-40倍后，將其與用雙蒸水稀釋至20 μ mol/L的內切酶接頭選擇性擴增引物、用雙蒸水稀釋至20 μ mol/L的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀釋10倍后的緩沖液和雙蒸水混合均勻后，進行PCR擴增，得PCR選擇性擴增產物；
所述內切酶接頭選擇性擴增引物為堿基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I選擇性擴增引物中的任意一條，或者堿基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I選擇性擴增引物中的任意一條；
所述的iPBS引物為喊基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一條； 所述步驟五的操作方法為:在微量PCR離心管中，加入稀釋到20ymol/L的內切酶接頭選擇性擴增引物5~10 μ 1，稀釋到20 μ mol/L的iPBS引物5~10 μ 1，稀釋10倍后的Buffer2.5 μ 1，含 Mg2+的溶液，的 L 875 μ 1，dNTP 0.5 μ I,Mse I 預擴增產物 0.5 μ l、EcoRI預擴增產物0.5μ l，Taq酶0.2μ 1，余量用雙蒸水補齊至25μ 1，置于PCR儀中，進行PCR選擇性擴增。所述PCR選擇性擴增，具體PCR程序為94°C 5min ；94°C 30s,68°C 30s _0.7°C循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 個循環；72°C 5min。
[0019]步驟六、首先制備6.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，取PCR選擇性擴增產物，加入染色液并點樣進行電泳，電泳完成后，銀染，觀察、拍照，分析結果。
[0020]實施例1
一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為:
步驟一、牡丹基因組DNA的提取:牡丹基因組DNA的獲得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40個牡丹品種(包括葛巾紫、萬花盛、島大臣、魯荷粉、呼紅、白玉、三變賽玉、種生紅、綠香球、雀好、二喬、烏龍捧盛、胭脂圖、紅冠玉帶、肉芙蓉、銀紅巧對、桃紅獻媚、金島、藍海碧波、虞姬艷裝、壽星紅、小胡紅、銀鱗碧珠、紅燈、盛丹爐、姚黃、萍實艷、羅漢紅、錦袍紅、紅蓮、佛門袈裟、冰山翡翠、首案紅、狀元紅、玫瑰紫、島錦、大花黃、紫牡丹、四川牡丹、楊山牡丹)的基因組DNA ；
步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:利用NEB公司酶切試劑盒中的Mse I和EcoR I限制性內切酶對制備的牡丹基因組DNA分別進行酶切:20 μ L的酶切反應液成分為:濃度為SOng/yL基因組DNA 5yL，稀釋10倍后的緩沖液4.2 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量為雙蒸水。
[0021]步驟三、所得酶切產物和接頭DNA的分別連接:取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產物8 μ L，MseI接頭引物(其堿基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接頭引物(其堿基序列如序列表序列3和序列4)各2.5yL，T4 DN A連接酶I μ L，稀釋10倍后的連接緩沖液r2.5 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下連接30min。
[0022]步驟四、連接產物的預擴增JfMse I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列5)和EcoR I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列6)稀釋至20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:連接產物2.5 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀釋后Mse I預擴增引物和EcoR I預擴增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，PCR擴增產物稀釋20-40倍后備用。將所配制的體系，均放入PCR儀，進行反應；具體PCR程序為94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 個循環；72°C IOmin0
[0023]步驟五、選擇性擴增反應:將選擇性擴增引物Mzx6 (其堿基序列如序列表序列7)和iPBS引物2224 (其堿基序列如序列表序列18)分別稀釋到20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:預擴增PCR產物稀釋液5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,選擇性擴增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L。將所得PCR反應液，均置于PCR儀中，進行反應，具體PCR程序為94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 個循環；72°C 5min)。[0024]步驟六、電泳檢測:首先制備6.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，取PCR擴增產物，加入染色液并點樣進行電泳，電泳完成后，銀染，觀察、拍照，電泳檢測結果如圖1所示。
[0025]實施例2
一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為:
步驟一、牡丹基因組DNA的提取:牡丹基因組DNA的獲得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40個牡丹品種(包括葛巾紫、萬花盛、島大臣、魯荷粉、呼紅、白玉、三變賽玉、種生紅、綠香球、雀好、二喬、烏龍捧盛、胭脂圖、紅冠玉帶、肉芙蓉、銀紅巧對、桃紅獻媚、金島、藍海碧波、虞姬艷裝、壽星紅、小胡紅、銀鱗碧珠、紅燈、盛丹爐、姚黃、萍實艷、羅漢紅、錦袍紅、紅蓮、佛門袈裟、冰山翡翠、首案紅、狀元紅、玫瑰紫、島錦、大花黃、紫牡丹、四川牡丹、楊山牡丹)的基因組DNA ；
步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:利用NEB公司酶切試劑盒中的Mse I和EcoR I限制性內切酶對制備的牡丹基因組DNA分別進行酶切:20 μ L的酶切反應液成分為:濃度為SOng/yL基因組DNA 8yL，稀釋10倍后的緩沖液4.2 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白
0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量為雙蒸水。
[0026]步驟三、所得酶切產物和接頭DNA的分別連接:取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產物8 μ L，MseI接頭引物(其堿基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接頭引物(其堿基序列如序列表序列3和序列4)各2.5yL，T4 DNA連接酶I μ L，稀釋10倍后的連接緩沖液r2.5 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下連接30min。
`[0027]步驟四、連接產物的預擴增JfMse I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列5)和EcoR I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列6)稀釋至20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:連接產物2.5 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5yL，1%(:12溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀釋后Mse I預擴增引物和EcoR I預擴增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，PCR擴增產物稀釋30倍后備用。將所配制的體系，均放入PCR儀，進行反應；具體PCR程序為94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 個循環；72°C IOmin0
[0028]步驟五、選擇性擴增反應:將選擇性擴增引物Ezxl2和iPBS引物2240分別稀釋到20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:預擴增PCR產物稀釋液5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5μ L，Mgcl2溶液
1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L，選擇性擴增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L ;將所得PCR反應液，均置于PCR儀中，進行反應，具體PCR程序為94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C / 循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s,72°C Imin 23 個循環；72°C 5min)。
[0029]步驟六、電泳檢測:首先制備6.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，取PCR擴增產物，加入染色液并點樣進行電泳，電泳完成后，銀染，觀察、拍照，電泳檢測結果如圖2所示。
[0030]實施例3
一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為:
步驟一、牡丹基因組DNA的獲得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40個牡丹品種(包括葛巾紫、萬花盛、島大臣、魯荷粉、呼紅、白玉、三變賽玉、種生紅、綠香球、雀好、二喬、烏龍捧盛、胭脂圖、紅冠玉帶、肉芙蓉、銀紅巧對、桃紅獻媚、金島、藍海碧波、虞姬艷裝、壽星紅、小胡紅、銀鱗碧珠、紅燈、盛丹爐、姚黃、萍實艷、羅漢紅、錦袍紅、紅蓮、佛門袈裟、冰山翡翠、首案紅、狀元紅、玫瑰紫、島錦、大花黃、紫牡丹、四川牡丹、楊山牡丹)的基因組DNA;
步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:利用NEB公司酶切試劑盒中的Mse I和EcoR I限制性內切酶對制備的牡丹基因組DNA分別進行酶切:20 μ L的酶切反應液成分為:濃度為SOng/yL基因組DNA 8yL，稀釋10倍后的緩沖液4.2 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量為雙蒸水。
[0031]步驟三、所得酶切產物和接頭DNA的分別連接:取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產物8 μ L，MseI接頭引物(其堿基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接頭引物(其堿基序列如序列表序列3和序列4)各2.5 μ L，T4 DNA連接酶I μ L，稀釋10倍后的連接緩沖液r2.5 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下連接30min。
[0032]步驟四、連接產物的預擴增JfMse I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列5)和EcoR I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列6)稀釋至20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:連接產物2.5 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5yL，1%(:12溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀釋后Mse I預擴增引物和EcoR I預擴增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，PCR擴增產物稀釋40倍后備用。將所配制的體系，均放入PCR儀，進行反應；具體PCR程序為94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 個循環；72°C IOmin0
[0033]步驟五、選擇性擴增反應:將選擇性擴增引物Mzxll (其堿基序列如序列表序列8)和iPBS引物2249 (其堿基序列如序列表序列36)分別稀釋到20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:預擴增PCR產物稀釋液5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,選擇性擴增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L。將所得PCR反應液，均置于PCR儀中，進行反應，具體PCR程序為94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 個循環；72°C 5min)。
[0034]步驟六、電泳檢測
首先制備6.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，取PCR擴增產物，加入染色液并點樣進行電泳，電泳完成后，銀染，觀察、拍照，電泳檢測結果如圖3所示。
[0035]實施例4
一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為:
步驟一、牡丹基因組DNA的獲得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40個牡丹品種(包括葛巾紫、萬花盛、島大臣、魯荷粉、呼紅、白玉、三變賽玉、種生紅、綠香球、雀好、二喬、烏龍捧盛、胭脂圖、紅冠玉帶、肉芙蓉、銀紅巧對、桃紅獻媚、金島、藍海碧波、虞姬艷裝、壽星紅、小胡紅、銀鱗碧珠、紅燈、盛丹爐、姚黃、萍實艷、羅漢紅、錦袍紅、紅蓮、佛門袈裟、冰山翡翠、首案紅、狀元紅、玫瑰紫、 島錦、大花黃、紫牡丹、四川牡丹、楊山牡丹)的基因組DNA;步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:利用NEB公司酶切試劑盒中的Mse I和EcoR I限制性內切酶對制備的牡丹基因組DNA分別進行酶切:20 μ L的酶切反應液成分為:濃度為SOng/yL基因組DNA 8yL，稀釋10倍后的緩沖液4.2 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L, Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量為雙蒸水。
[0036]步驟三、所得酶切產物和接頭DNA的分別連接:取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產物8 μ L，MseI接頭引物(其堿基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接頭引物(其堿基序列如序列表序列3和序列4)各2.5yL，T4 DNA連接酶I μ L，稀釋10倍后的連接緩沖液r2.5 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下連接30min。
[0037]步驟四、連接產物的預擴增JfMse I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列5)和EcoR I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列6)稀釋至20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:連接產物2.5 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀釋后Mse I預擴增引物和EcoR I預擴增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，PCR擴增產物稀釋40倍后備用。將所配制的體系，均放入PCR儀，進行反應；具體PCR程序為94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 個循環；72°C IOmin0
[0038]步驟五、選擇性擴增反應:將選擇性擴增引物Mzxl6 (其堿基序列如序列表序列9)和iPBS引物2255 (其堿基序列如序列表序列19)分別稀釋到20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:預擴增PCR產物稀釋液5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,選擇性擴增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L。將所得PCR反應液，均置于PCR儀中，進行反應，具體`PCR程序為94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 個循環；72°C 5min)。
[0039]步驟六、電泳檢測:首先制備6.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，取PCR擴增產物，加入染色液并點樣進行電泳，電泳完成后，銀染，觀察、拍照，電泳檢測結果如圖4所示。
[0040]實施例5
一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為:
(I)牡丹基因組DNA的獲得是利用改良的CTAB方法提取，共提取40個牡丹品種(包括葛巾紫、萬花盛、島大臣、魯荷粉、呼紅、白玉、三變賽玉、種生紅、綠香球、雀好、二喬、烏龍捧盛、胭脂圖、紅冠玉帶、肉芙蓉、銀紅巧對、桃紅獻媚、金島、藍海碧波、虞姬艷裝、壽星紅、小胡紅、銀鱗碧珠、紅燈、盛丹爐、姚黃、萍實艷、羅漢紅、錦袍紅、紅蓮、佛門袈裟、冰山翡翠、首案紅、狀元紅、玫瑰紫、島錦、大花黃、紫牡丹、四川牡丹、楊山牡丹)的基因組DNA;
步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:利用NEB公司酶切試劑盒中的Mse I和EcoR I限制性內切酶對制備的牡丹基因組DNA分別進行酶切:20μ L的酶切反應液成分為:濃度為SOng/yL基因組DNA 8yL，稀釋10倍后的緩沖液4.2 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L，Mse I 酶 0.5 μ L, EcoR I 酶 0.5 μ L，余量為雙蒸水。
[0041]步驟三、所得酶切產物和接頭DNA的分別連接:取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:牡丹基因組DNA酶切產物8 μ L，MseI接頭引物(其堿基序列如序列表序列I和序列2)和EcoR I接頭引物(其堿基序列如序列表序列3和序列4)各2.5 μ L，T4 DNA連接酶I μ L，稀釋10倍后的連接緩沖液r2.5 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下連接30min。
[0042]步驟四、連接產物的預擴增JfMse I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列5)和EcoR I預擴增引物(其堿基序列如序列表序列6)稀釋至20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:連接產物2.5 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5yL，1%(:12溶液1.875 μ L，dNTPs 0.5 μ L，稀釋后Mse I預擴增引物和EcoR I預擴增引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L，PCR擴增產物稀釋40倍后備用。將所配制的體系，均放入PCR儀，進行反應；具體PCR程序為94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 個循環；72°C IOmin0
[0043]步驟五、選擇性擴增反應:將選擇性擴增引物Ezxl5其堿基序列如序列表序列11)和iPBS引物2399其堿基序列如序列表序列48)分別稀釋到20mol/L后備用；取微量PCR離心管，在每個微量PCR離心管內配制25 μ L PCR反應液，其成分為:預擴增PCR產物稀釋液5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5 μ L，Mgcl2溶液1.875 μ L，dNTP 0.5 μ L,選擇性擴增引物和引物各0.5 μ L，Taq酶0.2 μ L，余量用雙蒸水補齊至25 μ L。將所得PCR反應液，均置于PCR儀中，進行反應，具體PCR程序為94°C 5min ；94°C 30s, 68°C 30s -0.7°C/循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin 23 個循環；72°C 5min)。
[0044]步驟六、電泳檢測:首先制備6.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，取PCR擴增產物，加入染色液并點樣進行 電泳，電泳完成后，銀染，觀察。
【權利要求】
1.一種牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:其具體操作步驟為: 步驟一、提取牡丹基因組DNA ； 步驟二、牡丹基因組DNA的酶切:用限制性內切酶Mse I和限制性內切酶EcoR I對上述步驟一所提取的基因組DNA進行酶切，得到基因組DNA酶切產物； 步驟三、酶切產物和接頭DNA連接:將所得基因組DNA酶切產物、Mse I接頭引物、EcoRI接頭引物、T4 DNA連接酶和稀釋10倍后的連接緩沖液混合均勻后在溫度為16°C的條件下保溫30min，得到連接產物； 所述的Mse I接頭引物序列包括Mse I 5’端接頭引物和Mse I 3’端接頭引物，其堿基序列如序列表序列I和序列2 ； 所述的EcoR I接頭引物序列包括EcoR I 5’端接頭引物和EcoR I 3’端接頭引物，其堿基序列如序列表序列3和序列4 ； 步驟四、連接產物的預擴增: (1)、取上述步驟三所得部分連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20 μ mo I/L的Mse I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到Mse I預擴增產物； (2)、取上述步驟三所得剩余連接產物，將其與用雙蒸水稀釋10倍后的Buffer、含Mg2+的溶液、dNTPs、用雙蒸水稀釋至20 μ mo I/L的EcoR I預擴增引物、Taq酶和雙蒸水混合后，進行PCR擴增，得到E coR I預擴增產物； 所述的Mse I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列5;所述EcoR I預擴增引物，其堿基序列如序列表序列6 ； 步驟五、選擇性擴增:取上述步驟四得到的Mse I預擴增產物和EcoR I預擴增產物，分別用雙蒸水稀釋20-40倍后，將其與用雙蒸水稀釋至20μπιΟ1/1的內切酶接頭選擇性擴增引物、用雙蒸水稀釋至20μπιΟ1/1的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀釋10倍后的緩沖液和雙蒸水混合均勻后，進行PCR擴增，得PCR選擇性擴增產物； 所述內切酶接頭選擇性擴增引物為堿基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I選擇性擴增引物中的任意一條，或者堿基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I選擇性擴增引物中的任意一條； 所述的iPBS引物為喊基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一條； 步驟六、將所得PCR選擇性擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察結果。
2.如權利要求1所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:所述步驟二中基因組DNA酶切體系總量為20 μ L，包括濃度為50ng/ μ L基因組DNA5-10 μ L，稀釋10倍后的緩沖液4 2.0 μ L，稀釋100倍后的牛血清蛋白0.2 μ L7Mse I酶0.5 μ L，EcoR I酶0.5 μ L，余量為雙蒸水。
3.如權利要求1所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:所述步驟三的操作方法為:在微量PCR離心管中，加入基因組DNA酶切產物8 μ L，Mse I接頭引物2.5 μ L、EcoR I接頭引物2.5yL、T4 DNA連接酶I μ L、稀釋10倍后的連接緩沖液2.5 μ L，之后用雙蒸水補齊至25 μ L ;用移液槍槍頭將上述反應液吸打充分混勻，瞬時離心后在溫度為16°C的條件下保溫30min，得到連接產物。
4.如權利要求1所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:所述步驟四的操作方法為:在微量PCR離心管中，加入連接產物2.5 μ L，稀釋10倍后的緩沖液2.5μ L，含Mg2+的溶液1.875 μ L、dNTPs 0.5 μ L、Mse I預擴增引物0.5 μ L、EcoR I預擴增引物·0.5 μ L、Taq酶0.2 μ L，之后用雙蒸水補齊至25 μ L，置于PCR儀中，進行PCR預擴增。
5.如權利要求4所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:所述的PCR預擴增，具體 PCR 程序為 94°C Imin ；50°C 90s, 72°C 90s, 36 個循環；72°C IOmin0
6.如權利要求1所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:所述步驟五的操作方法為:在微量PCR離心管中，加入稀釋到20ymol/L的內切酶接頭選擇性擴增引物5~10 μ 1，稀釋到20ymol/L的iPBS引物5~10 μ 1，稀釋10倍后的Buffer2.5 μ 1，含Mg2+的溶液，的 1.875 μ 1，dNTP 0.5 μ I, Mse I 預擴增產物 0.5 μ 1、EcoR I 預擴增產物 0.5 μ 1，Taq酶0.2 μ I，余量用雙蒸水補齊至25 μ 1，置于PCR儀中，進行PCR選擇性擴增。
7.權利要求6所述的牡丹基因組DNA分子標記方法，其特征在于:所述PCR選擇性擴增，具體 PCR 程序為 94 °C 5min ；94°C 30s, 68 °C 30s -0.7°C 循環，72°C Imin 12 個循環，再進行 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C ·Imin 23 個循環；72°C 5min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103820546SQ201410055992
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月19日 優先權日:2014年2月19日
【發明者】郭大龍, 侯小改, 段亞賓, 魏冬峰, 呂靜霞 申請人:河南科技大學