用于穩健t細胞和抗體應答的pr13.5啟動子的制作方法
【專利說明】用于穩健T細胞和抗體應答的PR13. 5啟動子
[0001] 發明背景
[0002] MVA來源于安卡拉皮膚痘苗毒株（安卡拉尿囊絨膜痘苗（CVA)病毒），所述病毒在 Vaccination Institute, Ankara, Turkey保持許多年并且用作對人進行疫苗接種的基礎。 然而，由于通常發生與痘苗病毒（VACV)相關聯的嚴重接種后并發癥，曾經多次試圖產生更 加減毒、更安全的天花疫苗。
[0003] 在1960年至1974年期間，Prof. Anton Mayr通過在CEF細胞中連續傳代570次 以上來成功地將CVA減毒（Mayr 等人，1975, Passage History:Abstammung，Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA. Infection 3:6-14)。作為作 為預天花疫苗的MVA的早期開發的一部分，在處于來自痘苗的不良反應的風險下的受試者 中，曾經使用MVA-517(對應于第517次傳代）以及Lister Elstree(Stickl, 1974, Smallpox vaccination and its consequences:first experiences with the highly attenuated smallpox vaccine"MVA".Prev.Med. 3(1) :97_101;Stickl 和 Hochstein-Mintzel，1971，I ntracutaneous smallpox vaccination with a weak pathogenic vaccinia virus(〃MVA virus〃）.Munch Med Wochenschr. 113:1149-1153)來進行臨床試驗。1976 年，在德國，來 源于MVA-571種子儲備（對應于第571次傳代）的MVA作為兩階段腸胃外天花疫苗接 種程序中的初免疫苗（primer vaccine)加以注冊。隨后，MVA-572在大約120, 000名高 加索人個體中使用，大部分兒童在1與3歲之間，并且未報道了嚴重副作用，雖然許多受 試者處于具有與常規痘苗病毒相關聯的并發癥高風險的群體之中（Mayr等人，1978, The smallpox vaccination strain MVA:marker,genetic structure,experience gained with the parenteral vaccination and behaviour in organisms with a debilitated defence mechanism(作者翻譯）.Zentralbl. Bacteriol. (B) 167:375-390)。MVA-572 作 為 ECACC V94012707 寄存于 European Collection of Animal Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology andResearch, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP40JG,United Kingdom。
[0004] 因為許多傳代用于將MVA減毒，所以取決于CEF細胞中的傳代數目，存在許多不同 毒株或分離物。所有MVA毒株來源于Dr. Mayr并且大多數從在德國的天花根除程序期間 使用的MVA-572,或廣泛用作獸醫疫苗的MVA-575得到。MVA-575于2000年12月7日在 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)以寄存編號 V0012〇7〇7 寄存。
[0005] 通過CVA在原代雞胚胎成纖維細胞中的連續繁殖（超過570次傳代），獲得減毒的 CVA-病毒MVA(改良的安卡拉痘苗病毒）。MVA由Bavarian Nordic進一步傳代并且被稱為 MVA-BN。與祖CVA病毒相比，MVA以及MVA-BN缺少大約13% (來自六個主要和多個次要缺 失位點的26. 5kb)的基因組。這些缺失影響許多毒力和宿主范圍基因，以及編碼A型包涵體 蛋白（ATI)的基因和編碼將成熟病毒粒子引導至A型包涵體中的結構蛋白質的基因的較大 片段。MVA-BN的樣品于2000年8月30日以編號V00083008寄存于European Collection of Cell Cultures(ECACC)〇
[0006] MVA-BN可連接并且進入人細胞，其中病毒編碼的基因非常有效地表達。然而，子 代病毒的組裝和釋放未發生。MVA-BN和衍生物的制劑已經施用至許多類型的動物，和超過 2000名人受試者，包括免疫缺陷個體。所有疫苗接種已經證明總體上安全并良好耐受的。
[0007] 來自許多不同出版物的認識是所有MVA毒株是相同的并且代表高度減毒、安全、 活病毒載體。然而，臨床前測試顯示與其它MVA毒株相比，MVA-BN展示極好的減毒和功效 (WO 02/42480)。如例如以編號V00083008寄存于ECACC的MVA變體毒株MVA-BN能夠在體 外在雞胚胎成纖維細胞（CEF)中繁殖性復制，但是不能夠在人細胞中繁殖性復制，其中MVA 575或MVA 572可繁殖性復制。舉例來說，MVA-BN在人角化細胞細胞系HaCaT、人胚胎腎細 胞系293、人骨骼骨肉瘤細胞系143B和人宮頸腺癌細胞系HeLa中不能繁殖性復制。此外， 在不能產生成熟B和T細胞并且因此嚴重免疫受損并對于復制病毒非常敏感的小鼠模型 中，MVA-BN毒株不能復制。MVA-BN毒株的額外或替代性質是在與DNA初免/痘苗病毒加強 方案相比時，能夠在痘苗病毒初免/痘苗病毒加強方案中誘導至少基本上相同水平的免疫 力。
[0008] 術語"不能繁殖性復制"在本申請中如WO 02/42480和美國專利6, 761，893中所定 義來使用，所述文獻通過引用并入本文。因此，此術語適用于使用美國專利6, 761，893中所 描述的測定在感染之后4天具有小于1的病毒擴增率的病毒，所述測定通過引用并入本文。 病毒的"擴增率"是從感染細胞產生的病毒（輸出）與最初用于首先感染細胞的量（輸入） 的比率。輸出與輸入之間的"1"的比率定義從感染細胞產生的病毒的量與最初用于感染細 胞的量相同的擴增狀態。
[0009] 根據一個實施方案，MVA-BN或它的衍生物的特征是在與DNA初免/痘苗病毒加強 方案相比時，在痘苗病毒初免/痘苗病毒加強方案中誘導至少基本上相同水平的免疫力。 痘苗病毒被視為在與DNA初免/痘苗病毒加強方案相比時，在痘苗病毒初免/痘苗病毒加 強方案中誘導至少基本上相同水平的免疫力，只要在與DNA初免/痘苗病毒加強方案相比 時，在痘苗病毒初免/痘苗病毒加強方案中，如在W002/42480所公開的"測定1"和"測定 2"之一，優選地在兩種測定中所測量的CTL應答至少基本上相同。更優選地，在與DNA初 免/痘苗病毒加強方案相比時，痘苗病毒初免/痘苗病毒加強施用之后的CTL應答在至少 一個測定中較高。最優選地，CTL應答在兩種測定中較高。
[0010] WO 02/42480公開如何獲得具有MVA-BN的性質的痘苗病毒。高度減毒MVA-BN病 毒可例如通過改良的安卡拉痘苗病毒（MVA)諸如MVA-572或MVA-575的進一步傳代來獲 得。
[0011] 總之，與其它MVA毒株相比，MVA-BN已被證明具有最高減毒特征并且甚至在嚴重 免疫受損動物中是安全的。
[0012] 雖然MVA在哺乳動物細胞中展現強烈減弱的復制，但是它的基因被有效 地轉錄，并且病毒復制的阻斷是在病毒組裝和釋出（egress)水平上。（Sutter和 Moss， 1992,Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A 89:10847-10851 ;Carroll 和 Moss，1997, Host range and cytopathogenicity ofthe highly attenuated MVA strain of vaccinia virus:propagation and generation of recombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line. Virology 238:198-211.)盡管它的高度減毒和減少的毒力，在臨床前研究中， MVA-BN已被證明引起對于VACV和克隆至MVA基因組中的異源基因產物的體液和細胞免 疫應答（Harrer 等人，2005, Therapeutic Vaccination of HlV-1-infected patients on HAART with recombinant HIV-lnef-expressing MVA:safety, immunogenicity and influence on viral load during treatment interruption. Antiviral Therapy 10:285-300 ;Cosma 等人，2003, Therapeutic vaccination with MVA-HIV-lnef elicits Nefspecific T-helper cell responses in chronically HIV-linfected individuals. Vaccine 22(1):21-29 ;Di Nicola 等人，2003,Clinical protocol. Immunization of patients with malignant melanoma with autologous CD34(+)cell-derived dendritic cells transduced ex vivo with a recombinant replication-deficient vaccinia vector encoding the human tyrosinase gene:a phase I trial. Hum Gene Ther. 14(14):1347_1360;DiNicola 等人，2004，Boosting T cell-mediated immunity to tyrosinase by vaccinia virus-transduced, CD34(+)-derived dendritic cell vaccination:a phase I trial in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 10(16) : 5381-5390.)
[0013] MVA-BN和基于重組MVA-BN的疫苗可在無血清培養基中培養的CEF細胞中生成、傳 代、產生并制造。已經表征用于臨床前和臨床開發的許多重組MVA-BN變體。在MVA-BN、病 毒載體骨架與各種基于重組MVA的疫苗之間未觀察到減毒（在人細胞系中缺少復制）或安 全（臨床前毒性或臨床研究）方面的差異。
[0014] 誘導針對由VACV載體表達的外源基因產物的強的體液和細胞免疫應答受以下事 實阻礙：外源基因產物必須與VACV載體的所有超過150種抗原競爭來識別并誘導特定抗體 和T細胞。特定問題是阻止誘導針對外源基因產物的強的CD8T細胞應答的載體CD8T細胞 表位的免疫顯性°(5111；[1：11等人，11111]111110(1〇111；[仙110601^0叉￥；[四1-8口6(^；[(30'1^ in a human trial of recombinant-modified vaccinia Ankara. J. Immunol. 175