膽道閉鎖及淤膽型嬰兒肝炎綜合征的microRNA血清標志物檢測及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明涉及一類可用于區分膽道閉鎖及齡 膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的microRNA血清標志物的檢測W及用途。本發明還涉及檢測所 述microRNA標志物的芯片和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 膽道閉鎖是W肝內外膽管閉鎖和梗阻性黃痘為特點的小兒外科常見崎形，其發病 率為1/5000-1/8000。是一種發生于兒童，W進行性硬化性膽管炎癥，各級膽管梗阻和破壞， 肝纖維化和肝硬化形成為基本病理特點的疾病。許多患兒往往在確診膽道閉鎖時即已存在 嚴重的肝臟纖維化，并且很快發展成為肝硬化，最終導致肝功能衰竭。因此，膽道閉鎖的盡 早診斷就愈發顯得迫切。
[0003] 基因作為生命的遺傳介質，在生物體的生、老、病、死中處于基礎內因的地位。絕大 部分基因通過轉錄生成核糖核酸，再翻譯生成蛋白質而發揮生物學功能。
[0004] microRNA(微小RNA)是一類在較高等的真核生物體內廣泛存在的，長度約21到 23個堿基的單鏈RNA分子。它可W通過堿基配對原則特異性地與一些mRNA上的祀位點相 結合，引起祀mRNA降解或翻譯抑制，進而在轉錄后水平對祀基因進行調控。從而抑制轉錄 后基因表達，在調控基因表達、細胞周期、生物體發育時序等方面起重要作用。在動物中，一 個微RNA通常可W調控數十個基因。
[0005]microRNA來源于長度約為lOOObp的長鏈RNA初始轉錄產物（Pri-microRNA)， Pri-microRNA分子在細胞核中經化osha酶剪切形成長度約60-8化t的具有莖環結構的 microRNA前體。microRNA前體轉運至胞質后，被Dicer酶進一步切割成長約22nt的雙鏈 microRNA。雙鏈microRNA解開后，成熟的microRNA進入RNA誘導基因沉默復合物，與互補 mRNA完全或不完全配對，降解祀mRNA或阻遏其表達。
[0006] 盡管microRNA在細胞總RNA中所占的比重很小，但由于它可W高效地對所有具有 祀位點的mRNA產生調控作用，microRNA在生物體的發育乃至疾病的發生、發展過程所起的 作用仍不可小視。然而，迄今為止，本領域對于與膽道閉鎖相關的microRNA了解甚少，因 此本領域迫切需要進一步地分離各種microRNA,尤其是與疾病的發生、預后或檢測有關的 microRNA。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一類新的、可用于區分膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患 兒的microRNA標志物及其在制備相關疾病檢測制劑中的應用。
[0008] 本發明的另一目的就是提供所述microRNA標志物的檢測方法，該方法比現有檢 測技術省時、靈敏度與準確度更高、成本更低、和/或更高效。
[0009]本發明提供了hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429在 制備膽道閉鎖診斷制劑中的應用。
[0010]例如，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 作為區分膽 道閉鎖或者齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的microRNA血清標志物。又如，將hsa-miR-150、 hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429作為治療或者輔助治療膽道閉鎖或者齡 膽型嬰兒肝炎綜合征的藥劑的篩藥祀標。
[0011]試驗表明，膽道閉鎖血清中，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化表達量 高于齡膽型嬰兒肝炎綜合征，而hsa-miR-4429表達量下降。表達量差異具有統計學意義上 的顯著性差異。
[0012] 本發明提供 了檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的表達的方法：
[0013] (1)米用microRNA芯片技術檢測膽道閉鎖血清中hsa-miR-150、hsa-miR-4689、 hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表達；
[0014] 或者
[0015] (2)采用英光定量PCR技術檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429的表達情況。
[0016]所述的檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表 達所用的探針，包括：
[0017]CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(沈Q ID N01);
[0018]UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(沈Q ID N02);
[001 引UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC(SEQID N03);
[0020] AAAAGCUGGGCUGAGAGGCG(SEQID N04)。
[0021] 本發明提供了一種芯片，該芯片偶聯檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、 hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的探針。
[0022] 上述芯片，可W用于檢測樣品中hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的表達；檢測方法包括步驟：
[002引 （1)提供分離的血清RNA樣品，在所述的RNA上設置標記物；
[0024]似將（1)的RNA與所述的芯片接觸，使所述的RNA與固相載體上的寡核巧酸探針 發生雜交反應，從而在固相載體上形成"寡核巧酸探針-RNA"二元復合物；
[002引 做檢測似形成的二元復合物的標記物，從而確定血清RNA樣品中 hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表達。
[0026]所述的檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表 達所用的探針，包括：
[OOW] CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(沈Q ID N01);
[0028] UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(沈Q ID N02);
[002引 UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC(SEQID N03);
[0030]AAAAGCUGGGCUGAGAGGCG(SEQID N04)。
[0031] 本發明還提供了一種檢測試劑盒。
[0032] 所述的試劑盒含有上述芯片，或者含有檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、 hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的探針。
[0033]所述的檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429的表 達所用的探針，包括：
[0034] CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(沈Q IDN01);
[00巧]UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(沈Q IDN02);
[003引 UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC (SEQ IDN03);
[0037] AAAAGCUGGGCUGAGAGGCG (SEQ IDN04)。
[0038] 所述的試劑盒中可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑。
[0039]所述的試劑盒可W包括檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的引物對。
[0040]所述的試劑盒還可W包括hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的標準品。
[0041] 所述的試劑盒能夠用于檢測區分膽道閉鎖或者齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的 microRNA血清標志物。
[0042] 具體而言，在第一方面，本發明提供了膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的 差異表達microRNA可作為診斷標志物。
[0043]本發明中，多方面試驗表明hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429可作為膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征的分子標志及其藥物篩選祀標：
[0044] 1，利用microRNA芯片（Agilent human miRNA8*60K V18. 0)比較了膽道閉鎖及 齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒血清的microRNA表達譜，發現膽道閉鎖血清中，hsa-miR-150、 hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化表達量高于齡膽型嬰兒肝炎綜合征，而hsa-miR-4429表達 量下降（p<0.005,差異大于2倍)。
[0045] 2,利用英光定量PCR技術，對差異表達的microRNA進一步驗證，發現膽道閉鎖血 清中，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化表達量高于齡膽型嬰兒肝炎綜合征，而 hsa-miR-4429 表達量下降（p<0. 01)。
[0046] 3,利用英光定量PCR技術，通過雙盲檢查，發現聯合應用hsa-miR-150、 hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-4429區分膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患 兒的靈敏度和特異性均大于90%。
[0047]本發明的試驗結果表明，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429在膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒血清中表達明顯差異，聯合應用可 作為具有較高靈敏度與準確度的診斷標志物，有效地提高膽道閉鎖的診斷水平。
[004引在第二方面，本發明提供了用于檢測的hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-4429檢測芯片、檢測試劑盒、基因診斷用的英光定量PCR 試劑盒。所述試劑盒中，其包括基于hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429的特異性探針與引物對。
[0049]本發明經實驗證實，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、hsa-miR-4429可作為一種有效的診斷標志物。具體的，hsa-miR-150、hsa-miR-