用腫瘤壞死因子受體相關因子6篩選抗腫瘤藥物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種篩選抗腫瘤藥物的方法，特別是設及一種用腫瘤壞死因子受體相 關因子6篩選抗腫瘤藥物的方法。
【背景技術】
[0002] Akt(也稱作蛋白激酶B，P邸）是一個在進化上高度保守的絲蘇氨酸蛋白激酶，在 人癌中經常高度激活。Akt異常激活意味著腫瘤細胞對于調亡誘導的耐受，細胞增殖、生長、 代謝的異常增加。Akt在絕大多數癌癥中存在著過度激活的情況，暗示著Akt的激活在腫瘤 發生中的重要角色。關于Akt被活化后是如何被募集到細胞膜上的分子機制，最近，有人報 道了腫瘤壞死因子受體相關因子6 (TRAF6)是一種E3泛素連接酶，可W泛素化修飾Akt,從 而促進Akt轉移到細胞膜上，并被激活。
[0003] 腫瘤，特別是惡性腫瘤的產生嚴重影響人們的健康，甚至危及人的生命，快速的發 現抗腫瘤藥物，可W盡可能地減少腫瘤的發生和發展，特別是一些副作用少的抗腫瘤藥物， 更是目前亟需的。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種用腫瘤壞死因子受體相關因子6篩選抗腫瘤藥物的方 法。
[0005] 本發明的技術方案概述如下：
[0006] 用腫瘤壞死因子受體相關因子6 (TRAF6)篩選抗腫瘤藥物的方法，包括如下步驟： WSEQIDNO. 1所示的TRAro作為檢測祀點的活性口袋，與天然產物數據庫或商用小分子 數據庫中的小分子，利用AUT0D0CK軟件進行活性口袋與小分子的對接，分析對接結果，根 據打分指標預測小分子與活性口袋的親和力大小，篩選具有潛在抗腫瘤活性的小分子，通 過實驗驗證小分子的抗腫瘤活性。
[0007] 所述小分子為奎寧、奎寧了或辛可寧。
[000引本發明的優點是：
[0009] 針對在癌癥中高表達的激酶，選擇令其活化的關鍵酶，確定藥物的作用祀點，快速 篩選出副作用少、抗腫瘤療效高的小分子抗腫瘤藥物。
【附圖說明】
[0010] 圖1 (A)是（1S)-嗟咐-4-基巧-己締基奎寧-2-基）甲醇（辛可寧）的分子結 構式及其與TRAro的結合位點；炬）是（1時-(6-甲氧基嗟咐-4-基）（（1S，4S，5時-5-己締 基奎寧-2-基）甲醇（奎寧）的分子結構式及其與TRAF6的結合位點；（C)為（S)-化-甲 氧基嗟咐-4-基）（（1S，2R，4S，5時-5-己締基奎寧-2-基）甲醇（奎寧了）的分子結構式 及其與TRAF6的結合位點。
[0011] 圖2辛可寧（圖中A)、奎寧（圖中B)、奎寧了（圖中C)對子宮頸癌細胞系化la 細胞的生長抑制作用，加藥后（a) 72小時化），（b)96h，用MIT法測定的細胞生長狀況。
[0012] 圖3辛可寧（圖中A)、奎寧（圖中B)、奎寧了（圖中C)對肺癌細胞系A-549細胞 的生長抑制作用，加藥后（a) 7化，（b)96h，用MIT法測定的細胞生長狀況。
[0013] 圖4培養化la細胞添加不同濃度化合物后4她，用流式細胞儀檢測AnnexinV和 PI的表達（a)辛可寧，化）奎寧和（C)奎寧了誘導細胞早期調亡的作用。
[0014] 圖5培養A549細胞的Bax/Bcl的表達，（a)加奎寧1化、2化、4她、7化和96h后， 化）（a)圖中的條帶用ImageJ軟件（NationalInstitutesofHealth)半定量測定后，計算 Bax/ 0 -actin和Bel/ 0 -actin的比值用柱狀圖表示。
[00巧]圖6加1. 5Xl(T4mol/L的奎寧分別刺激3、6、12和2化，再加20yg/ml的LPS刺激 化后，Westernblot法測定磯酸化Akt(pAkt)的結果，柱狀圖是用ImageJ軟件Optional InstitutesofHealth)半定量測定pAkt和P-actin的條帶（a)為A-549 細胞（b)為 化la細胞
[0016] 圖7培養化la細胞加化合物奎寧作用3, 6, 12, 2化后，提取蛋白質用TRAro抗體 進行免疫共沉淀后檢測Akt表達，（a)五個條帶分別為；1 ;空白對照；2,加奎寧后化；3 ;加 奎寧后化；4 ;加奎寧后12h;5 ;加奎寧2化；化）用ImageJ軟件OptionalInstitutesof Health)半定量測定Akt和TRAro的條帶，柱狀圖表示Akt/TRAro的比值。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。本發明的實施例是為了使本領域 的技術人員能夠實施，但并不對本發明作任何限制。其中的常用試劑的公開了是為了使本 領域的技術人員更好的實施本發明，但并不對本發明作任何限制。
[001引 實施例1
[0019] 用計算機模擬篩選技術，篩選出TRAro相關小分子化合物：
[0020] 蛋白結構信息獲取；從RCSB蛋白質數據庫中下載TRAro蛋白結構（PDBID;3肥T) 用SEQIDNO. 1所示，W其作為檢測祀點的活性口袋；將天然產物數據庫或商用小分子數據 庫中的小分子，進行對接前的加氨，加電荷等處理；利用AUT0D0CK軟件進行活性口袋與小 分子的對接，分析對接結果，根據打分指標預測小分子與活性口袋的親和力大小，并分析各 種參數的相互關系及對結合能的貢獻，篩選具有潛在抗腫瘤活性的小分子奎寧、奎寧了和 辛可寧（圖1)。
[002。TRAF6是有523個氨基酸結構的細胞內泛素酶，我們選擇TRAF6為作用祀點，首先 用計算機輔助設計找到能夠與泛素結合酶結合位點（即TRAro的第50-80,90-110氨基酸） 結合的小分子化合物，合成或購買其中幾種化合物后，測試其抗腫瘤活性及作用的分子機 制。
[0022] 用計算機輔助設計找到能夠與TRAF6的第50-80,90-110氨基酸的2個W上氨基 酸結合的小分子化合物，建立化合物作用祀點；
[0023] 分別檢測幾種化合物對不同腫瘤細胞的生長抑制作用，和誘發細胞調亡的作用；
[0024] 實施例2
[00巧]實施例1篩選的化合物奎寧、奎寧了和辛可寧對腫瘤細胞生長的影響：
[0026]培養化la細胞和A-549細胞（購自沈陽萬類生物科技有限公司），W4000個/孔 的細胞密度接種到96孔板，培養24小時化）后，分別加入1X1(T6, 5X10^5,1X10^5, 5Xi(T4， 1X1〇-4, 2. 5X1〇-4, 5Xl〇-4mol/L濃度的奎寧、奎寧了或者辛可寧，分別培養4她，72h和96h 后用MIT法測細胞生長狀況，其結果總結為圖2和圖3,圖2顯示3種化合物都能有濃度依 存性地抑制化la細胞的生長，圖3顯示3種化合物都能有濃度依存性地抑制A-549細胞的 生長。圖中A、B、C各代表辛可寧（A)、奎寧炬）、奎寧了（C)。
[0027]MIT法：每孔加入5mg/ml的MIT溶液20y1，培養箱中解育化后取出，棄去上清， 每孔加150y1二甲基亞諷溶解甲瑣沉淀，用酶標儀在490nm下測定吸光度值。
[0028] 圖2、3為加入化合物后72和9化的細胞生長結果統計并W柱狀圖表示，實驗結果 表明3種化合物都可W抑制Hela細胞（圖2)和A-549細胞（圖3)的生長，表明3種化合 物都有抗腫瘤活性。
[002引實施例3
[0030] 早期細胞調亡的檢測--流式細胞
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