水稻上兩種種傳病害的多重pcr檢測試劑盒及其專用引物和多重pcr檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及兩種植物病原的分子生物學檢測技術領域，具體涉及到水稻白葉 枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的多重分子生物學檢測方法。
【背景技術】
[0002] 我國是農產品貿易的第四大進口國和第五大出口國，經濟全球化的趨勢下使我國 對外貿易的進一步擴大，植物及其產品的調運日趨頻繁，同時也帶來了較為嚴重的有害生 物的入侵威脅，這己經成為危害我國生物多樣性、生態環境和國民經濟的一個十分重要和 緊迫的問題。現如今，我國的水稻種子產業市場相比于東南亞以及南美等主要水稻生產國 相比，優勢較明顯，不論品種類別還是貿易方式都逐漸趨于多樣化。但是由于經濟利益的驅 動，一些不法商販私自生產，經營水稻種子。這不僅嚴重的損害了我國種子出口的質量和信 譽，也導致了偽劣，帶毒或者不適合區域種植條件的種子流入市場。各出入境口岸及產地植 物病害檢驗檢疫迫切要求高效靈敏、快捷簡便的診斷技術及工具，以加強口岸檢疫，構筑防 范外來疫害入侵的第一道屏障，對保障我國農業生產安全，服務于農產品的出口和國內貿 易具有重大的現實意義。
[0003] 本發明所述的水稻上兩種種傳病害是指分別由水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起的水稻白葉枯病和由水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)引起的水稻細菌性條斑病。
[0004] 水稻白葉枯病是由水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae)引起的一 種水稻的重要檢疫性種傳病害。其菌體呈短桿狀，單胞，單鞭毛，極生或亞極生，無芽 抱，無英膜，菌體外具粘質的胞外多糖包圍，革蘭氏染色陰性，好氣性。在肉汁胨瓊脂培 養基培養基上菌落蜜黃色或淡黃色，圓形，周邊整齊，質地均勻，表面隆起，光沿發亮， 粘性，產生非水溶性的黃色素。病菌生長最適溫度為25-30°C，最低5°C，最高40°C，在 無膠膜保護下53°C 10分鐘致死，有膠膜保護下57°C 10分鐘致死。病菌最適宜酸堿度為 ρΗ6· 5-7. 0〇
[0005] 該種病菌又稱白葉瘟、地火燒、茅草瘟等。水稻的整個生育期均可被害，尤其苗期、 分穗期受害最重，各個器官均可染病，葉片最易染病。且該病菌不僅會附著在種子表面有 時還會寄存在種子內部。其癥狀因病菌侵入部位、品種抗病性、環境條件有較大差異，常見 的主要有葉枯型、急性凋萎型、褐斑或褐變型3種類型：
[0006] ( -）葉枯型，主要為害葉片，嚴重時也為害葉鞘，發病先從葉尖或葉緣開始，先 出現暗綠色水浸狀線狀斑，很快沿線狀斑形成黃白色病斑，然后沿葉緣兩側或中肋擴展， 變成黃褐色，最后呈枯白色，病斑邊緣界限明顯。
[0007] (二）急性凋萎型，從苗期到分孽期，病菌從根系或莖基部傷口侵入維管束時易發 病。并且主莖同時發病，心葉失水青枯，凋萎死亡，其余葉片也先后青枯卷曲，然后全株 枯死，也會有僅僅心葉枯死的情況。
[0008] (三）褐斑或褐變型，在抗病品種上較多見，病菌通過人工剪葉或傷口侵入，在氣 溫低或不利發病條件，病斑外圍出現褐色壞死反應帶時，會停滯擴展。
[0009] 黃化型癥狀較不多見，其主要表現在早期心葉不枯死，且會產生不規則褪綠斑， 在染病后期會發展為枯黃斑。
[0010] 該病菌作為一種水稻重要檢疫性種傳病害，危害僅次于水稻細菌性條斑病，在我 國除新疆、西藏和西南稻區以外，各大產區均有發生，云南省就有105個縣發生此病。該病 對產量影響較大，產量減少達20% -30%，嚴重時可達50% -60%，甚至顆粒無收。一般秈 稻傷害重于粳糯稻，晚稻傷害重于早稻。其寄主除水稻外，還包括陸稻，野生稻，菱白和李 氏禾為自然寄主植物，但這些植物上發病不甚常見。除此之外還有菱白和李氏禾屬的鞘糠 草，批殼草，千金子和蛆子草等。
[0011] 目前，水稻白葉枯病自1884年在日本發生以來，相繼在亞洲、歐洲、大洋洲、非洲 和北美洲均有發現。其發生范圍己遍及全球水稻栽培地區，在世界各國有記載發病的國家 就有日本，美國，中國等27個國家其中以日本，印度以及中國發病較為嚴重。
[0012] 水稻條斑病菌屬于原核生物界（Procaryotes)，薄壁細菌門（Gracilicutes)， 黃單胞菌科黃單胞菌屬（Xanthomonas)的稻黃單胞菌。病菌大小約為1.0-2. 5 μπι或 0. 4-0. 6 μ m。單胞偶爾成對，但不成鏈狀，不形成芽孢和莢膜，具有端生單鞭毛，能游動，無 孢子，無莢膜。革蘭氏染色反應陰性，生長最適溫度為25 - 28°C，致死溫度為51°C。在肉 汁胨瓊脂培養基上病原菌生長快，菌落常呈淡黃色，圓形，光滑，邊緣規則，圓頂狀，粘稠狀， 好氣。該病菌與水稻白葉枯病菌的致病性和表現性狀雖有很大不同，但其遺傳性狀及生理 生化性狀又有很大相似性，故該菌應作為稻白葉枯病菌種內的一個變種。
[0013] 細菌性條斑病，又稱細條病、條斑病。是由細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)引起的一種水稻的重要檢疫性種傳病害。主要為害水稻葉片以及幼齡葉片。 從苗期到抽穗期都會發生，但以分蘗期到抽穗前期發病為多。且該病菌不僅會附著在種子 表面有時還會寄存在種子內部。病斑局限于葉脈間薄壁細胞，初為深綠色水浸狀半透明小 點，很快在葉脈間向上下擴展，成為淡黃色狹條斑，由于受葉脈限制病斑不寬，少數情況 下病菌能越過葉脈橫向擴展。抗病品種上病斑很短，大小約1x10mm，感病品種上病斑較長， 有時可達30-50mm.或更長，許多病斑可連成大塊枯死斑。病斑兩端呈浸潤型綠色。病斑上 常溢出大量串珠狀黃色菌膿，干后呈膠狀小粒。白葉枯病斑上菌溢不多不常見到，而細菌 性條斑上則常布滿小珠狀細菌液。除水稻外，還有澳洲稻、闊葉稻、菱白以及許多野生稻等 均可受侵染而發病，如 Oryza latifolia, Oryza brachyantha, Oryza breviligulate 等。 近年來在長江流域雜交晚稻上亦有大面積發生。水稻細菌性條斑病對秈稻的危害性最大， 已上升為華南、中南稻區上的主要細菌病害。
[0014] 目前，水稻細菌性條斑病主要分布在熱帶和亞熱帶地區，如菲律賓、泰國、印度 等，從地區分布來看，主要集中在亞洲和非洲。在我國水稻細菌性條斑病主要分布在南方 省區，如廣東、貴州、云南、四川、浙江、江西、湖南、湖北等。
[0015] 2007年，我國農業部頒布了《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名 錄》，公布了包括有害昆蟲、軟體動物、真菌、原核生物、線蟲和病毒等，共435種有害生 物。其中侵染水稻作物的種傳病害主要是水稻細菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)、水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae)等。這兩種病菌不僅 都能侵染水稻作物并且都能通過帶菌種子進行遠距離傳播.以及借風雨、灌溉水和昆蟲傳 播以及農事操作的刀具、器皿等進行近距離.導致農產品產量下降，極大的阻礙了我國農 業發展.
[0016] 目前，癥狀觀察是進行植物病原檢測常用的一種方法，癥狀觀察法是通過直接觀 察植物受害部位的病狀特征以達到檢測的目的。病狀類型主要有：萎蔫，斑點潰瘍，軟腐 病，畸形和瘡痂等。癥狀觀察時著重注意的是發病的部位、癥狀變化的范圍及不同發病個體 之間癥狀特征的比較，但是有的病害發病特征卻極其相似，僅憑肉眼難以區分，當兩種或 以上病害侵染同一植株時也難以辨別.比如水稻細菌性條斑病菌和水稻白葉枯病菌僅憑 肉眼難以區分，在復合侵染時僅憑癥狀觀察更難以區分。
[0017] 顯微鏡觀