一種蝙蝠草多糖分離純化方法及其產品和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及天然產物分離純化領域，具有涉及一種蝙蝠草多糖分離純化方法。
【背景技術】
[0002] 多糖（polysaccharides)是由單糖連接形成的大分子物質，不同生物體內提取的 多糖具有不同的生理作用。蝙蝠草為我國壯族的傳統民族草藥，來源于豆科蝙蝠草屬植物 蝙蝠草（Christia vespertilionis (L. f.) Bahn. f·)，主要分布于我國廣西、廣東、海南 島。當地民間以其全草代茶飲，也以全草入藥，水煎服主治肺結核、癰腫瘡毒等。目前，對蝙 蝠草的現代化研宄報道很少，并僅局限于資源分布、種屬鑒別、栽種用途，對蝙蝠草化學成 分的研宄至今未見報道，蝙蝠草多糖的研宄亦屬空白。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種分離純化蝙蝠草多糖的方法，希望能夠提取出一種新 型多糖，該多糖具有獨特的功效，能夠為蝙蝠草資源的開發利用提供技術指導。本發明的目 的是通過以下技術方案實現的： 一種蝙蝠草多糖的分離純化方法，包括蝙蝠草多糖的提取和蝙蝠草多糖的純化兩個步 驟， 所述蝙蝠草多糖的提取包括以下步驟： a. 水提：蝙蝠草全草以無水乙醇回流提取1~3次后得到殘渣，所述殘渣以沸水提取 20~60min得到沸水提取混合物，所述沸水提取混合物冷卻后以2500~3500r/min離心取上 清液，所述上清液50°C減壓濃縮得濃縮提取液； b. 醇沉：將步驟a所得的濃縮提取液冷卻至20°C加入無水乙醇，至提取液中乙醇的體 積分數為80%，將提取液置于0~4°C放置10~14小時后取出，棄去上清液得沉淀物；將所述 沉淀物揮干乙醇后以水溶解再次離心，離心后取上清液再次以80%乙醇沉淀，0~4°C放置 10~14小時后棄上清液得二次沉淀物，重復此處理2~5次，得到的最終沉淀物加水制備成水 溶液； c. 除蛋白：將步驟b所得的水溶液以Sevag法除蛋白10~15次后濃縮水層得粗多糖溶 液； d. 冷凍干燥：將步驟c所得的粗多糖溶液冷凍干燥得蝙蝠草粗多糖，分別以無水乙醇、 丙酮洗滌蝙蝠草粗多糖2~5次后，真空冷凍干燥，即得蝙蝠草多糖初品； 所述蝙蝠草多糖的純化為將所述蝙蝠草多糖初品依次經過離子交換色譜柱分離純化、 透析、瓊脂糖凝膠柱分離純化后干燥得到蝙蝠草多糖。
[0004] 作為對純化步驟的改進，所述蝙蝠草多糖的純化包括以下步驟： a. 離子交換色譜柱分離純化：將所述蝙蝠草多糖初品加蒸餾水溶解，料液比為 5~7g/100ml，以離子交換色譜柱分離，分別采用蒸餾水及0. 18~0. 22mol/L NaCl溶液洗脫； b. 透析：將步驟a中NaCl溶液洗脫部分濃縮后以截留分子量2000Da的透析袋進行透 析，先以自來水透析，再以蒸餾水透析； C.瓊脂糖凝膠柱分離純化：步驟b中透析后截留物質通過瓊脂糖凝膠柱分離純化，以 蒸餾水洗脫，棄去前端1. 5倍凝膠柱體積的洗脫液，收集后續1倍凝膠柱體積的洗脫液干 燥。
[0005] 進一步的，蝙蝠草多糖的純化步驟a中稱取5~7g所述蝙蝠草多糖初品溶于100mL 蒸餾水中，離子交換色譜柱柱體積500mL，NaCl溶液濃度為0. 2mol/L ;步驟b中自來水透析 時間為2天，蒸餾水透析時間為1天；步驟c中瓊脂凝膠柱柱體積200mL，棄去前300mL洗 脫液，收集后續200mL洗脫液。
[0006] 本發明的另一目的是通過以下方案實現的： 一種利用上述分離純化方法得到的蝙蝠草多糖。
[0007] 進一步的，所述蝙蝠草多糖為均一組分。
[0008] 進一步的，所述蝙蝠草多糖的分子量為220000Da。
[0009] 進一步的，所述蝙蝠草多糖的旋光度為+38. 5°。
[0010] 進一步的，所述蝙蝠草多糖由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質的量 的比為 2. 44:1:6. 54: L 28。
[0011] 本發明的另一目的是通過以下方案實現的： 一種利用上述分離純化方法得到的蝙蝠草多糖在抗氧化和提高免疫力方面的應用。
[0012] 本發明的有益效果： 本發明提供了一種操作簡便、無污染、適合工業化生產的提取分離純化蝙蝠草多糖的 方法，填補了目前蝙蝠草成分分析、提取的空白；通過本發明的方法提取的蝙蝠草多糖為均 一組分，該多糖在清除DPPH自由基、提供機體免疫力方面具有一定功效，有潛力被開發應 用于醫用、保健領域，制備成抗氧化、抗炎性、治療免疫性疾病類藥物。
【附圖說明】
[0013] 圖1為蝙蝠草多糖高效液相色譜圖； 圖2為蝙蝠草多糖對RAW264. 7小鼠巨噬細胞增殖能力的影響； 圖3為蝙蝠草多糖對RAW264. 7小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響； 圖4為蝙蝠草多糖對小鼠巨噬細胞產生NO的影響。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1 一種蝙蝠草多糖的分離純化方法，包括蝙蝠草多糖的提取和蝙蝠草多糖的純化兩個步 驟， 所述蝙蝠草多糖的提取包括以下步驟： a. 水提：蝙蝠草全草以無水乙醇回流提取1~3次后得到殘渣，所述殘渣以沸水提取 20~60min得到沸水提取混合物，所述沸水提取混合物冷卻后以2500~3500r/min離心取上 清液，所述上清液50°C減壓濃縮得濃縮提取液； b. 醇沉：將步驟a所得的濃縮提取液冷卻至20°C加入無水乙醇，至提取液中乙醇的體 積分數為80%，將提取液置于0~4°C放置10~14小時后取出，棄去上清液得沉淀物；將所述 沉淀物揮干乙醇后以水溶解再次離心，離心后取上清液再次以80%乙醇沉淀，0~4°C放置 10~14小時后棄上清液得二次沉淀物，重復此處理2~5次，得到的最終沉淀物加水制備成水 溶液； c. 除蛋白：將步驟b所得的水溶液以Sevag法除蛋白10~15次后濃縮水層得粗多糖溶 液； d. 冷凍干燥：將步驟c所得的粗多糖溶液冷凍干燥得蝙蝠草粗多糖，分別以無水乙醇、 丙酮洗滌蝙蝠草粗多糖2~5次后，真空冷凍干燥，即得蝙蝠草多糖初品； 所述蝙蝠草多糖的純化為將所述蝙蝠草多糖初品依次經過離子交換色譜柱分離純化、 透析、瓊脂糖凝膠柱分離純化后干燥得到蝙蝠草多糖。所述蝙蝠草多糖的純化包括以下步 驟： a.離子交換色譜柱分離純化：將所述蝙蝠草多糖初品加蒸餾水溶解，料液比為 5~7g/100ml，以離子交換色譜柱分離，分別采用蒸餾水及0. 18~0. 22mol/L NaCl溶液洗脫； b.透析：將步驟a中NaCl溶液洗脫部分濃縮后以截留分子量2000Da的透析袋進行透析， 先以自來水透析，再以蒸餾水透析； c.瓊脂糖凝膠柱分離純化：步驟b中透析后截留物質通過瓊脂糖凝膠柱分離純化，以 蒸餾水洗脫，棄去前端1. 5倍凝膠柱體積的洗脫液，收集后續1倍凝膠柱體積的洗脫液干 燥。
[0015] 實施例2 在實施例1的基礎上進一步優化。
[0016] 所述蝙蝠草多糖的提取包括以下步驟： a. 水提：蝙蝠草全草750g，切成3cm，以無水乙醇回流提取2次后得到殘渣，所述殘渣 以沸水提取30min得到沸水提取混合物，所述沸水提取混合物冷卻后以2000r/min離心取 上清液，所述上清液50°C減壓濃縮得濃縮提取液150mL ; b. 醇沉：將步驟a所得的濃縮提取液冷卻至20°C加入無水乙醇，至提取液中乙醇的體 積分數為80%，將提取液置于4°C放置12小時后取出，棄去上清液得沉淀物；將所述沉淀物 揮干乙醇后以水溶解再次離心，離心后取上清液再次以80%乙醇沉淀，4°C放置12小時后 棄上清液得二次沉淀物，重復此處理3次，得到的最終沉淀物加水制備成水溶液； c. 除蛋白：將步驟b所得的水溶液以Sevag法除蛋白12次后濃縮水層至100mL得粗 多糖溶液； d. 冷凍干燥：將步驟c所得的粗多糖溶液冷凍干燥得蝙蝠草粗多糖，分別以200mL無 水乙醇、丙酮洗滌蝙蝠草粗多糖3次后，真空冷凍干燥，即得蝙蝠草多糖初品； 所述蝙蝠草多糖的純化為將所述蝙蝠草多糖初品依次經過離子交換色譜柱分離純化、 透析、瓊脂糖凝膠柱分離純化后干燥得到蝙蝠草多糖。所述蝙蝠草多糖的純化包括以下步 驟： a. 離子交換色譜柱分離純化：將所述蝙蝠草多糖初品6. 08g加蒸餾水100mL溶解，以 DEAE DE-52離子交換色譜柱分離，柱體積500ml，分別采用蒸餾水及0. 2mol/L NaCl溶液洗 脫，每個洗脫梯度收集3. OL ; b. 透析：將步驟a中NaCl溶液洗脫部分濃縮后以截留分子量2000Da的透析袋進行透 析，先以自來水透析2天，再以蒸餾水透析1天； C.瓊脂糖凝膠柱分離純化：步驟b中透析后截留物質通過Sepharose CL-68瓊脂糖 凝膠柱分離純化，柱體積200ml，以蒸餾水洗脫，棄去前端300ml洗脫液，接下來收集洗脫液 200ml，干燥得蝙蝠草多糖。
[0017] 所得蝙蝠草多糖將高效液相色譜檢測結果為單峰，證明為均一組分。
[0018] 高效液相檢測條件為：TSK G5000PWXL凝膠色譜柱，柱溫40°C，純水為流動相，流 速0. 8 mL/min，RID檢測。色譜圖如圖1。
[0019] 實施例3 對實施例2所述的均一組分的蝙蝠草多糖進行特性測定。
[0020] 1)旋光度測定 稱取蝙蝠草多糖10. 0 mg，以水溶解，定容至25 mL，以水為空白，自動旋光儀測量