旋光 度，經計算，得[αΓ?D=+38. 5°。
[0021] 2 )分子量分布的測定 以HPLC對系列多糖標準品和蝙蝠草多糖進行測定，TSK G5000PWXL凝膠色譜柱，柱溫 40°C，純水為流動相，流速0. 8 mL/min，RID檢測。
[0022] 分別稱取適量的分子量為 12000Da、25000Da、50000Da、80000Da、270000Da、460000 Da的Dextran標準品，加入去離子水，將其配成濃度約2 mg/ml的對照品溶液，0. 45 μ m水 系濾膜過濾，之后逐一進行HPLC檢測，以保留時間（RT)為橫坐標X，分子量的IoglO值為縱 坐標 y，得標準曲線 y = -0.332X + 10.224 (r = 0.998)。
[0023] 稱取一定量的蝙蝠草多糖，按上述方法進行檢測，以蝙蝠草保留時間依上述標準 曲線公式進行計算，得蝙蝠草多糖的Mw為220000 Da。
[0024] 3)單糖組成的測定 將蝙蝠草多糖進行全水解還原衍生化，以標準單糖為參照，對蝙蝠草多糖進行單糖組 成的測定，氣相條件為，色譜柱：DB-5 (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι);檢測器：質譜檢測 器；進樣口溫度：250 °C ;檢測器溫度：280 °C ;氮氣流速：0. 6 mL/min ;分流比：20:1 ;進樣 量：5 yL;升溫程序：200 °C保持2min，以3 °C/min的速率升至245 °C，再以10 °C/min 的速率升至270 °C，保持2 min。測得本實施例中蝙蝠草多糖由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和 半乳糖組成，其中各單糖物質的量比為2.44 : 1 : 6.54 : 1.28。
[0025] 實施例4 對實施例2所述的均一組分的蝙蝠草多糖進行體外實驗測定。
[0026] 1)蝙蝠草多糖的清除自由基活性測定 取0. 5mg/mL蝙蝠草多糖水溶液l.OmL，置IOmL比色管中，加入3. OmL濃度為0. lmmol/L的DPPH溶液，水浴30°C避光反應30min，以蒸餾水為空白，于517nm波長處測定吸 光值。按下列公式計算DPPH自由基清除率。 DPPH I'! ! I i }：'f -?; I ) -[A,,-!： As-A<;I]/ A0 X IOfB>〇 Λ Ψ . A<,-】Om L ? fiS 水 f 3 OmLDPPH 溶液的 ft .? 垵衍 As......... LOmI. fi i#ii + 3LDPPII m{ft 1?It )tfl'i At - ] Λιι L f i: W溶液.f :U)m L .4:水乙酔的吸.ft度ff丨.
[0027] 將實驗重復六次，求得蝙蝠草多糖的DPPH自由基清除率為28. 99% 以樣品對DPPH自由基的清除率作為評價指標。蝙蝠草多糖對0.1 mmol/L的DPPH溶 液的自由基清除率為28. 99 %(RSD=2. 28 %)。
[0028] 2)蝙蝠草多糖對小鼠巨噬細胞增殖的影響 以DMEM培養基培養小鼠巨噬細胞Raw264. 7,將細胞轉移至96孔板，濃度約為2 X IO4 個/ml，按照不同濃度向各孔加入蝙蝠草多糖溶液，培養12小時后，各孔加入MTT，培養4小 時，傾出培養液，各孔加入DMS0,靜置1小時，以酶標儀測定吸光度，統計結果。
[0029] 測定蝙蝠草多糖對RAW264. 7小鼠巨噬細胞增殖能力的影響，不同濃度給藥結果 見圖2。
[0030] 圖2中與空白對照組比較，* P〈 0· 05 ;** P〈 0· 01。其他各圖同。
[0031] 3)蝙蝠草多糖對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響 以DMEM培養基培養小鼠巨噬細胞Raw264. 7,將細胞轉移至96孔板，濃度約為2 X IO4 個/ml，按照不同濃度向各孔加入蝙蝠草多糖溶液，培養12小時后，各孔加入中性紅溶液， 培養4小時，傾出培養液，各孔加入DMS0,靜置1小時，以酶標儀測定吸光度，統計結果。
[0032] 以中性紅作為目標異物，測定蝙蝠草多糖對RAW264. 7小鼠巨噬細胞吞噬能力的 影響，不同濃度給藥結果見圖3。
[0033] 4)蝙蝠草多糖對小鼠巨噬細胞產生NO的影響 采用硝酸還原酶法測定細胞培養上清液中Ν0Γ間接反映生成NO的量，按照NO檢測試 劑盒說明書進行操作，不同濃度給藥對小鼠巨噬細胞產生總NO的結果見圖4。
[0034] 蝙蝠草多糖具有一定的清除DPPH自由基的能力，在以不同濃度蝙蝠草多糖考察 對小鼠巨噬細胞影響的實驗中，隨著給藥濃度的增加，蝙蝠草多糖促進小鼠巨噬細胞的增 殖的能力、促進細胞吞噬和產生NO的能力的作用增強。但是當濃度過高時，相應以上指標 反而出現下降，推測與大劑量蝙蝠草多糖作用于細胞干擾了細胞代謝或產生了細胞毒作用 有關。
【主權項】
1. 一種蝙蝠草多糖的分離純化方法，其特征在于：包括蝙蝠草多糖的提取和蝙蝠草多 糖的純化兩個步驟， 所述蝙蝠草多糖的提取包括以下步驟： a. 水提：蝙蝠草全草以無水乙醇回流提取1~3次后得到殘渣，所述殘渣以沸水提取 20~60min得到沸水提取混合物，所述沸水提取混合物冷卻后以2500~3500r/min離心取上 清液，所述上清液50°C減壓濃縮得濃縮提取液； b. 醇沉：將步驟a所得的濃縮提取液冷卻至20°C加入無水乙醇，至提取液中乙醇的體 積分數為80%，將提取液置于0~4°C放置10~14小時后，棄去上清液得沉淀物；將所述沉淀物 揮干乙醇后以水溶解再次離心，離心后取上清液再次以80%乙醇沉淀，0~4°C放置10~14小 時后棄上清液得二次沉淀物，重復此處理2~5次，得到的最終沉淀物加水制備成水溶液； c. 除蛋白：將步驟b所得的水溶液以Sevag法除蛋白10~15次后濃縮水層得粗多糖溶 液； d. 冷凍干燥：將步驟c所得的粗多糖溶液冷凍干燥得蝙蝠草粗多糖，分別以無水乙 醇、丙酮洗滌蝙蝠草粗多糖2~5次后，真空冷凍干燥，即得蝙蝠草多糖初品； 所述蝙蝠草多糖的純化為將所述蝙蝠草多糖初品依次經過離子交換色譜柱分離純化、 透析、瓊脂糖凝膠柱分離純化后干燥得到蝙蝠草多糖。
2. 根據權利要求1所述的分離純化方法，其特征在于：所述蝙蝠草多糖的純化具體包 括以下步驟： a. 離子交換色譜柱分離純化：將所述蝙蝠草多糖初品加蒸餾水溶解，料液比為 5~7g/100ml，以離子交換色譜柱分離，分別采用蒸餾水及0. 18~0. 22mol/L NaCl溶液洗脫； b. 透析：將步驟a中NaCl溶液洗脫部分濃縮后以截留分子量2000Da的透析袋進行透 析，先以自來水透析，再以蒸餾水透析； c. 瓊脂糖凝膠柱分離純化：步驟b中透析后截留物質通過瓊脂糖凝膠柱分離純化，以 蒸餾水洗脫，棄去前端1. 5倍凝膠柱體積的洗脫液，收集后續1倍凝膠柱體積的洗脫液干燥 得到蝙蝠草多糖。
3. 根據權利要求2所述的分離純化方法，其特征在于：蝙蝠草多糖的純化步驟a中稱 取5~7g所述蝙蝠草多糖初品溶于100mL蒸餾水中，離子交換色譜柱柱體積500mL，NaCl溶 液濃度為〇. 2mol/L ;步驟b中自來水透析時間為2天，蒸餾水透析時間為1天；步驟c中瓊 脂凝膠柱柱體積200mL，棄去前300mL洗脫液，收集后續200mL洗脫液干燥得到蝙蝠草多糖。
4. 一種利用權利要求1~3中任意一項分離純化方法得到的蝙蝠草多糖。
5. 根據權利要求4所述的蝙蝠草多糖，其特征在于：所述蝙蝠草多糖為均一組分。
6. 根據權利要求5所述的蝙蝠草多糖，其特征在于：所述蝙蝠草多糖的分子量為 220000Da〇
7. 根據權利要求5所述的蝙蝠草多糖，其特征在于：所述蝙蝠草多糖的旋光度為 +38.5。。
8. 根據權利要求5所述的蝙蝠草多糖，其特征在于：所述蝙蝠草多糖由阿拉伯糖、木 糖、葡萄糖和半乳糖組成，其物質的量的比為2. 44:1:6. 54:1. 28。
9. 一種利用權利要求1~3中任意一項分離純化方法得到的蝙蝠草多糖在抗氧化、提高 免疫力、抗炎性方面的應用。
【專利摘要】本發明為一種蝙蝠草多糖的分離純化方法，包括蝙蝠草多糖的提取和蝙蝠草多糖的純化兩個步驟，首先以無水乙醇除雜后將蝙蝠草全草的殘渣用沸水提取，提取液冷卻后離心取上清液，將上清液減壓濃縮以后加入無水乙醇沉淀、靜置，得到沉淀物再次離心，離心后取上清液再加入乙醇沉淀，重復操作后得到最終沉淀物除去蛋白冷凍干燥得到蝙蝠草多糖初品，將初品依次經過離子交換色譜柱分離純化、透析、瓊脂糖凝膠柱分離純化后干燥得到蝙蝠草多糖。通過該方法能夠提取到均一成分的蝙蝠草多糖，該多糖具有清除自由基及提高免疫力的作用，且提取方法簡單、無污染、適于工業化生產。
【IPC分類】A61P39-06, C08B37-00, A61P37-04, A61K31-715, A61P29-00
【公開號】CN104877037
【申請號】CN201510260399
【發明人】范海濤, 辛秀蘭, 蘭蓉, 王曉杰, 張虎成, 王維彬, 楊國偉, 劉鈺
【申請人】北京電子科技職業學院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年5月21日