一種無血清的人羊膜間充質干細胞培養基及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于干細胞技術領域，涉及一種無血清的人羊膜間充質干細胞培養基及其制備方法。
【背景技術】
[0002]人羊膜間充質干細胞源自胎盤羊膜組織，是具有明顯可塑性和多向分化潛能的一種成體干細胞，在不同生長因子的調節下，可分化成來源于3個胚層的不同組織細胞類型，如脂肪細胞、成骨細胞、肝樣細胞、心肌樣細胞、神經膠質細胞、神經元細胞和胰島樣細胞等。除此，人羊膜間充質干細胞不表達主要組織相容性II類抗原，微量表達主要組織相容性I類抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫調節功效，移植后的人羊膜間充質干細胞分泌的營養因子，具有促血管生成、促細胞生長、抗炎癥和抗纖維化等作用。
[0003]傳統的含動物血清的干細胞培養基給干細胞的生產與科研帶來多種不利因素。血清能為干細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白和其它營養物質，但其存在諸多缺點:批間差異較大，來源不穩定，需要大量驗證工作，價格昂貴，使用不方便，成分不明確，有抑制細胞生長的成分，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。無血清培養基是在基礎培養基的基礎上，加入成分明確的血清替代成分，既能滿足干細胞的培養要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因此，發展無血清培養基是干細胞走向臨床應用的重要條件。
[0004]目前已有一些市售間充質干細胞無血清培養基，比如LifeTechnology的間充質干細胞無血清培養基StemP1 SFM。但是，現有市售無血清培養基存在細胞貼壁差、操作不便等缺陷。比如Gibco無血清培養基、Stem CELL無血清培養基的應用需要進行培養瓶包被。此外，這些培養基培養的細胞增殖速率不夠理想。
[0005]中國專利CN 101914490公開了一種人羊膜間充質干細胞無血清培養基，該培養基以DMEM/F12為基礎培養基，添加了人血清白蛋白、人轉鐵蛋白、人胰島素和亞砸酸鈉，實現了人羊膜間充質干細胞的培養，但該培養基缺少貼壁因子，會導致細胞貼壁性較差，細胞因此無法增殖。
[0006]中國專利CN 102433302公開了一種無血清培養基，該培養基以DMEM/F12為基礎培養基，但該發明培養基僅有一種貼壁因子，細胞貼壁性能不夠理想。
[0007]因此，現有技術存在細胞貼壁性差，細胞增殖速率不夠理想等問題。
【發明內容】
[0008]為解決現有技術中存在的細胞貼壁性差，細胞增殖速率不夠理想等問題，發明人通過大量試驗篩選，得到一種新的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，該培養基無需進行培養瓶包被，操作簡便，細胞貼壁性和形態良好，細胞增殖速率高。
[0009]本發明的目的將通過下面的詳細描述來進一步體現和說明。
[0010]本發明提供一種無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，包括MDM基礎培養基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~5mg/mL、重組轉鐵蛋白1~5 μ g/mL、維生素C5~50 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~5mg/mL、成纖維細胞生長因子5~50ng/mL、血小板衍生生長因子5~50ng/mL、表皮生長因子5~50ng/mL、胰島素樣生長因子5~50ng/mL、轉化生長因子5~50ng/mL、纖維連接蛋白5~50ng/mL、胎球蛋白0.5~5mg/mL、腐胺鹽2~20 μ g/mL和重組人激活素2~20ng/mL。
[0011]采用上述技術方案的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，無需添加動物血清，可以實現人羊膜間充質干細胞的快速增殖，維持良好的干細胞幼稚狀態，具有良好的細胞誘導分化潛能。
[0012]本發明提供的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基中，通過纖維連結蛋白(fibronectin)和胎球蛋白(Fetuin)的協同作用，大大增強了人羊膜間充質干細胞的貼壁性能；腐胺鹽酸鹽有助于維持干細胞的幼稚狀態，防止干細胞的老化；重組人激活素則可促進羊膜間充質干細胞的增殖。
[0013]優選地，本發明提供的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，包括MDM基礎培養基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素0.5~2mg/mL、重組轉鐵蛋白1~4 yg/mL、維生素C 5~30 μ g/mL、人血清白蛋白0.5~2mg/mL、成纖維細胞生長因子5~20ng/mL、血小板衍生生長因子5~20ng/mL、表皮生長因子5~20ng/mL、胰島素樣生長因子5~20ng/mL、轉化生長因子5~20ng/mL、纖維連接蛋白5~20ng/mL、胎球蛋白0.5~3mg/mL、腐胺鹽5~15 μ g/mL和重組人激活素5~15ng/mL。
[0014]更優選地，本發明提供的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，包括IMDM基礎培養基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉鐵蛋白2.5yg/mL、維生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白lmg/mL、成纖維細胞生長因子10ng/mL、血小板衍生生長因子10ng/mL、表皮生長因子10ng/mL、胰島素樣生長因子10ng/mL、轉化生長因子1ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、腐胺鹽10 μ g/mL和重組人激活素1ng/
mLo
[0015]優選地，所述成纖維細胞生長因子為堿性成纖維細胞生長因子，所述血小板衍生生長因子為roGF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1，所述轉化生長因子為轉化生長因子-β，所述腐胺鹽為腐胺鹽酸鹽，所述重組人激活素為重組人激活素Α。
[0016]優選地，本發明提供的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，還包括1%體積百分比的非必需氨基酸，例如購自廣州賽業生物科技有限公司的非必須氨基酸，貨號ΝΕΑΑ-10201-100。
[0017]相應地，本發明還提供無血清的人羊膜間充質干細胞培養基的制備方法，包括如下步驟:向MDM基礎培養基中，按所述濃度加入重組人胰島素母液、重組轉鐵蛋白母液、維生素C母液、人血清白蛋白、成纖維細胞生長因子母液、血小板衍生生長因子母液、表皮生長因子母液、胰島素樣生長因子母液、轉化生長因子母液、纖維連接蛋白母液、胎球蛋白母液、腐胺鹽母液和重組人激活素母液，攪拌均勻，過膜除菌即得。
[0018]優選地，所述成纖維細胞生長因子為堿性成纖維細胞生長因子，所述血小板衍生生長因子為roGF-bb，所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子-1，所述轉化生長因子為轉化生長因子-β，所述腐胺鹽為腐胺鹽酸鹽，所述重組人激活素為重組人激活素Α。
[0019]相應地，本發明還提供無血清的人羊膜間充質干細胞培養基在人羊膜間充質干細胞培養中的用途。
[0020]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明提供了一種新的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，與傳統的含血清培養基和其他無血清培養基相比，本發明提供的培養基培養的人羊膜間充質干細胞能夠保持較好的干細胞幼稚形態，具有更好的細胞增殖速率、細胞干性和細胞誘導分化潛能。本發明提供的制備方法簡單，制得的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基用于人羊膜間充質干細胞的培養，表現出優異的細胞性能。
【附圖說明】
[0021]圖1不同配方的人羊膜間充質干細胞培養基對細胞增殖的影響。
[0022]圖2P5代人羊膜間充質干細胞在3種培養基中培養的形態。
[0023]圖3人羊膜間充質干細胞在3種培養基中的增殖曲線。
[0024]圖4P3代人羊膜間充質干細胞在3種培養基中的細胞克隆數量。
[0025]圖5培養基I培養的P5代人羊膜間充質干細胞的表面抗原表達水平。
[0026]圖6培養基2培養的P5代人羊膜間充質干細胞的表面抗原表達水平。
[0027]圖7培養基3培養的P5代人羊膜間充質干細胞的表面抗原表達水平。
[0028]圖83種培養基培養的P5代人羊膜間充質干細胞的成脂誘導分化染色結果圖。
[0029]圖93種培養基培養的P5代人羊膜間充質干細胞在誘導培養基中的成脂誘導分化相關基因FABP4的表達結果圖。
[0030]圖103種培養基培養的P5代人羊膜間充質干細胞的成骨誘導分化染色結果圖。
[0031]圖113種培養基培養的P5代人羊膜間充質干細胞在誘導培養基中的成骨誘導分化相關基因OPN的表達結果圖。
【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0033]本發明中的各組分均為常規市售產品。本發明中，培養基1:本發明實施例二提供的無血清的人羊膜間充質干細胞培養基；培養基2:Life Tecnology公司的的StemPro MSCSFM無血清培養基，貨號A10332-01 ;培養基3:IMDM基礎培養基+10%體積百分比的FBS ；培養基4:與培養基I相比，不包括腐胺鹽酸鹽。培養基5:與培養基I相比，不包括重組人激活素A。
[0034]實施例一不同配方的人羊膜間充質干細胞培養基對細胞增殖的影響
發明人對無血清的人羊膜間充質干細胞培養基進行了大量試驗篩選。將Pl代HAMSC以5000個/cm2的密度接種于六孔板中，分別加入培養基1、培養基4和培養基5進行培養，每3天將細胞用0.25%胰酶消化，收集細胞并計算數量，并以5000個/cm2的密度再次接種培養，直至P5代，根據每個代次的細胞收獲數量，繪制細胞增殖曲線，結果如圖1所示。
[0035]從圖1可知，同時添加一定濃度的腐胺鹽酸鹽和重組人激活素A，可大幅提高細胞增殖速率，且細胞形態更優。
[0036]實施例二無血清的人羊膜間充質干細胞培養基
無血清的人羊膜間充質干細胞培養基，包括MDM基礎培養基，還包括如下組分及其濃度:重組人胰島素lmg/mL、重組轉鐵蛋白2.5 μ g/mL、維生素C 16.1 μ g/mL、人血清白蛋白 lmg/mL、bFGF 10ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β1ng/mL、纖維連接蛋白10ng/mL、胎球蛋白lmg/mL、腐胺鹽酸鹽1 μ g/mL和重組人激活素A10ng/mLo
[0037]制備方法:向MDM基礎培養基中，按所述濃度加入重組人胰島素母液、重組轉鐵蛋白母液、維生素C母液、人血清白蛋白、bFGF母液、PDGF-bb母液、EGF母液、IGF-1母液、TGF-β母液、纖維連接蛋白母液、胎球蛋白母液、腐胺鹽酸鹽母液和重組人激活素A母液，攪拌均勻，過膜除菌即得。