專利名稱：將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法
技術領域：
由于人羊膜間充質細胞(human Amnion mesenchymal cells, hAMCs)具有增殖活 性和多分化潛能等干細胞生物學特點，本發明涉及了一種將人羊膜間充質細胞誘導分化成 胰島分泌細胞的方法。
背景技術：
由于羊膜是來源于胎兒的產物，暴露于母體免疫系統監視下，其表面人類白細胞 抗原(HLA)-A、B、C低表達，不表達HLA-DR，提示羊膜移植不引發免疫排斥。間充質干細胞 是低免疫原性細胞，不引發異常淋巴細胞增殖反應，并且能通過抑制T細胞、B細胞和NK細 胞功能，影響樹突狀細胞活性，此外還可以產生各種生長因子、細胞因子、趨化因子和蛋白 酶來調節免疫反應和改變組織微環境，刺激內源性干細胞減輕免疫炎癥反應。人羊膜間充 質細胞低表達MHC-I，不表達MHC-II，可以避免免疫排斥反應，SUSANNE等對同一條件下人 羊膜間充質細胞、人羊膜上皮細胞與脂肪組織來源的干細胞的免疫調節活性進行比較，發 現羊膜來源的間充質干細胞和上皮干細胞免疫抑制作用的發揮依賴于細胞接觸和細胞劑 量。干細胞是一群具有極強自我更新能力和多向分化潛能的細胞，易分離，體外可大 量擴增，異體移植不引起免疫排斥反應。誘導分化的胰島細胞可以發揮對血糖的生理性調 節作用，被認為是獲取胰島細胞的最佳種子細胞。Lumelsky等[1]成功地將小鼠胚胎干細 胞(embryonic stem cells, ESCs)誘導分化為能分泌胰島素的細胞團。Assady等[2]證 實人ESCs可誘導分化成胰島分泌細胞。干細胞誘導分化為β細胞的基本原理是借助生物 因子啟動干細胞中PDX-I基因的表達，改變細胞原有形態，表達胰島特異性標記，胰島素、 胰高血糖素和胰多肽等。生物誘導因子包括堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生 長因子(HGF)、尼克酰胺及適當濃度的葡萄糖。
發明內容
本申請的發明目的在于提供一種將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞 的方法。為了完成本發明目的，本發明采用以下技術方案本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，它包括(1)在無 菌條件下，從一個胎盤中分離出人羊膜組織，放入生理鹽水中浸泡；(2)清洗上述人羊膜組織；(3)消化清洗后的人羊膜組織；(4)將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質細胞；(5)將人羊膜間充質細胞擴增到所需的數目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜間 充質細胞的懸濁液，使人羊膜間充質細胞的個數為IX IO6個/ml-2 X IOw個/ml ；其中
(6)將上述人羊膜間充質細胞懸液中用含有20% FBS的α -MEM的培養基調整到 人羊膜間充質細胞的個數為1 X IO5個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8_12小時細胞貼 壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預先誘導24小時后，誘導為中間絲蛋白 陽性細胞，再用無血清的高糖DMEM誘導10小時后，得到胰島分泌細胞；(7)取出一部分從步驟(6)中得到的細胞，用RT-PCR方法或免疫細胞化學方法檢 測上述細胞是否為胰島分泌細胞；本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其中所述的步驟 ⑵為倒掉步驟(1)的生理鹽水，用溫度為4°C的含有100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉 素混合液的生理鹽水對上述人羊膜組織進行清洗，直至人羊膜組織無任何雜質和血漬后， 在溫度為20 25°C的無菌間，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素的D-hank，s沖 洗上述人羊膜組織3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素D-hank’ s液 中浸泡2小時；2小時后用D-hank' s液清洗3-5遍；本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其中所述的步驟
(3)是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0.25%胰蛋白酶的消化液，放入37°C水浴鍋中 分兩次共消化45分鐘后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10% FBS和的DMEM/F12液終止消 化，將消化后的羊膜組織用D-hank’ s液清洗直至清洗液澄清為止；本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其中所述分兩次 共消化45分鐘是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C 水浴鍋中消化15分鐘后，倒掉上述消化液，然后再加入等體積的新0.25%胰蛋白酶消化 液，放入37°C水浴鍋中消化30分鐘后，倒掉上述消化液，在消化時每隔5分鐘晃動一次，使 人羊膜組織被充分地消化；本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其中所述的步驟
(4)中的將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質細胞是采取以下步驟(I)將消化后的人羊膜組織用剪刀剪成漿狀后放入燒杯中，加入等體積的0. 2% 膠原蛋白酶V，然后放入溫度為37°C的水浴鍋中消化20 30分鐘；(II)將消化后的羊膜漿狀液分別用60目細胞篩和200目細胞篩進行過濾，得到細 胞懸濁液；(III)用無血清DMEM/F12按1 1的比例稀釋上述過濾后細胞懸濁液，然后在室 溫下將其放入離心機內以2500r/min轉速離心10分鐘，10分鐘后將上述溶液中的上清液倒 掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管將細胞吹打均勻后，再將其放入離心機內以1500r/min轉 速離心5分鐘，5分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入含10% FBS的DMEM/F12培養 液后，用吸管將細胞吹打均勻后，使人羊膜間充質細胞個數為IX IO6個/ml-2 X IO6個/ml ；本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其中所述的步驟
(5)是將步驟(4)得到人羊膜間充質細胞和含10%FBS的DMEM/F12培養液放置在培養瓶 中，培養瓶在溫度為36. 5-37. 5 °C、飽和濕度、體積分數為4. 5%的CO2培養箱中培養，每2_3 天更換全部培養液，培養5-7天，觀察培養瓶中人羊膜間充質細胞融合達到85%以上時， 去掉培養液，用D-hank’ s液清洗兩遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消化液進行消化，在 消化過程中，用顯微鏡下觀察細胞的消化情況，當70%的細胞變化成圓形時，立即加入2ml DMEM/F12和10% FBS培養液終止消化，然后用力吹打培養瓶的壁，將貼壁的細胞吹打下來；將回收的間充質細胞放入離心機內以1500r/min轉速每次離心5分鐘，共計兩次，然后倒掉 上清液，并計算細胞的個數；將上述回收的間充質細胞1 X IO6個/ml-2X IO6個/ml的密度 重復上述操作進行傳代接種培養，直至達到所需細胞數量；本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其中所述的步驟 (7)的用RT-PCR方法是檢測上述細胞相關基因表達，若上述細胞包括胰島素、葡萄糖轉運 2(GLUT2)、葡萄糖激酶、中間絲蛋白陽性細胞和胰腺和十二指腸同源盒(PDX-I)細胞，說明 從步驟(6)得到的細胞為胰島分泌細胞，否則，說明從步驟(6)得到的細胞不是胰島分泌細 胞；本發明將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其中所述的步驟 (7)的用免疫細胞化學方法是檢測上述細胞是否包括胰島素和C肽的表達，若上述細胞包 括胰島素和C肽的表達，說明從步驟(6)得到的細胞為胰島分泌細胞，否則，說明從步驟 (6)得到的細胞不是胰島分泌細胞。在成年機體中，間充質細胞存在于多種組織中，如骨髓、脂肪組織，但提取相當困 難。目前間充質細胞的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓間充質細胞(bone marrow-MCs, BM-MCs)細胞數量極少，Pittenger等發現僅0. 001% 0. 01 %的經過密度梯度分離的單核 細胞產生可塑性的貼壁細胞克隆，并且增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較 高，供者間充質細胞的采集須行骨髓穿刺術，使來源受到限制。而人類羊膜作為胚胎發育的 早期產物，無論從解剖結構還是在發育行為上，都包含有較為幼稚的胚胎干細胞及趨于成 熟的成體干細胞成分；羊膜組織在胎兒娩出后即完成使命，對其研究不會涉及倫理道德問 題；由于羊膜MCs是來源于胎兒的產物，暴露于母體免疫系統監視下，間充質細胞表面人類 白細胞抗原I(human leucocyte antigen，HLA)-A、B、C不表達，人類白細胞抗原HLA-DR低 表達，從羊膜分離出間充質細胞樣細胞，經體外擴增后成功植入新生大鼠和豬體內。上述優 勢使人羊膜間充質細胞有望成為人類組織工程和細胞治療的理想種子細胞。利用上述方法得到的胰島分泌細胞可以用于修復人體內的胰島組織。
圖1為用本發明方法所得到的胰島分泌細胞，即用體外人羊膜間充質細胞表達胰 島素的免疫化學形態圖；圖2為用本發明方法所得到的胰島分泌細胞，即用體外人羊膜間充質細胞表達胰 高血糖的免疫化學形態圖；圖3為體外培養人羊膜間充質細胞合成酶聯免疫分析圖。
具體實施例方式本發明一種將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，它包括(1)在無菌條件下，從一個從正常足月剖腹產胎兒的胎盤的臍帶面，鈍性分離出的 人羊膜組織，放入生理鹽水中浸泡；(2)倒掉步驟(1)的生理鹽水，用溫度為4°C的含有100IU/ml青霉素和1000ug/ml 鏈霉素混合液的生理鹽水對上述人羊膜組織進行清洗，直至人羊膜組織無任何雜質和血漬 后，在溫度為20 25°C的無菌間，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素的D-hank，s沖洗上述人羊膜組織3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素D-hank’ s 液中浸泡2小時；2小時后用D-hank’ s液清洗3_5遍；(3)將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C水浴 鍋中消化15分鐘后，倒掉上述消化液，然后再加入等體積的新0. 25%胰蛋白酶消化液，放 入37°C水浴鍋中消化30分鐘后，倒掉上述消化液，在消化時每隔5分鐘晃動一次，使人羊膜 組織被充分地消化，加入3ml的含10% FBS的DMEM/F12終止消化，將消化后的羊膜組織用 D-hank' s液清洗直至清洗液澄清為止；(4)將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質細胞；其中采用以下步驟(I)將消化后的人羊膜組織用剪刀剪成漿狀后放入燒杯中，加入等體積的0. 2% 膠原蛋白酶V，然后放入溫度為37°C的水浴鍋中消化20 30分鐘；(II)將消化后的羊膜漿狀液分別用60目細胞篩和200目細胞篩進行過濾，得到細 胞懸濁液；(III)用無血清DMEM/F12按1 1的比例稀釋上述過濾后細胞懸濁液，然后在室 溫下將其放入離心機內以2500r/min轉速離心10分鐘，10分鐘后將上述溶液中的上清液倒 掉，然后再加入DMEM/F12，用吸管將細胞吹打均勻后，再將其放入離心機內以1500r/min轉 速離心5分鐘，5分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入10% FBS和DMEM/F12培養液 后，用吸管將細胞吹打均勻后，使人羊膜間充質細胞個數為IX IO6個/ml-2 X IO6個/ml ；(5)將得到人羊膜間充質細胞和含10% FBS的DMEM/F12培養液放置培養瓶中，培 養瓶在溫度為36. 5-37. 5°C、飽和濕度、體積分數為4. 5%的CO2培養箱中培養，每2_3天更 換全部培養液，培養5-7天，觀察培養瓶中人羊膜間充質細胞融合達到85%以上時，去掉培 養液，用D-hank’ s液清洗兩遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消化液進行消化，在消化過 程中，用顯微鏡下觀察細胞的消化情況，當70%的細胞變化成圓形時，立即加入2ml含10% FBS的DMEM/F12培養液終止消化，然后用力吹打培養瓶的壁，將貼壁的細胞吹打下來；將回 收的間充質細胞放入離心機內以1500r/min轉速每次離心5分鐘，共計兩次，然后倒掉上清 液，并計算細胞的個數；將上述回收的間充質細胞1 X IO6個/ml-2X IO6個/ml的密度重復 上述操作進行傳代接種培養，直至達到所需細胞數量；(6)將上述人羊膜間充質細胞懸液中用含有20% FBS的α -MEM的培養基調整到 人羊膜間充質細胞的個數為1 X IO5個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8_12小時細胞貼 壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預先誘導24小時后，誘導為中間絲蛋白 陽性細胞，再用無血清的高糖DMEM誘導10小時后，得到胰島分泌細胞；(7)取出一部分從步驟(6)中得到的細胞用RT-PCR方法或免疫細胞化學方法檢測 上述細胞，檢測得到的細胞是否為胰島分泌細胞。其中所述的用RT-PCR方法是檢測上述細 胞相關基因表達，若上述細胞包括胰島素、葡萄糖轉運2(GLUT2)、葡萄糖激酶、中間絲蛋 白陽性細胞和胰腺盒十二指腸同源盒(PDX-I)細胞，說明從步驟(6)得到的細胞為胰島分 泌細胞，否則，說明從步驟(6)得到的細胞不是胰島分泌細胞；所述的用免疫細胞化學方法 是檢測上述細胞是否包括胰島素和C肽的表達，若上述細胞包括胰島素和C肽的表達， 說明從步驟(6)得到的細胞為胰島分泌細胞，否則，說明從步驟(6)得到的細胞不是胰島分 泌細胞。可以分別進行用RT-PCR方法或免疫細胞化學方法檢測，也可以即進行既用RT-PCR方法鑒定又免疫細胞化學方法進行檢測。圖1為用本發明方法所得到的胰島分泌細胞在細胞免疫熒光化學的結果，從圖3 中可以看出第一組對照組(control)為正常血清中胰島素的含量；第二組為人羊膜間充 質的胞漿(cytoplasm)中胰島素的含量；第三組為人羊膜間充質的上清液(supernatant) 中胰島素的含量，即用本發明的方法得到的胰島分泌細胞中胰島素的含量。以上方法只是對本發明的解釋，不是對發明的限定，本發明所限定的范圍參見權 利要求，在不違背本發明的精神的情況下，本發明可以作任何形式的修改。
權利要求
一種將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，它包括(1)在無菌條件下，從一個胎盤中分離出人羊膜組織，放入生理鹽水中浸泡；(2)清洗上述人羊膜組織；(3)消化清洗后的人羊膜組織；(4)將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質細胞；(5)將人羊膜間充質細胞擴增到所需的數目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜間充質細胞的懸濁液，使人羊膜間充質細胞的個數為1×106個/ml 2×106個/ml；其特征在于(6)將上述人羊膜間充質細胞懸液中用含有20％FBS的α MEM的培養基調整到人羊膜間充質細胞的個數為1×105個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8 12小時細胞貼壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預先誘導24小時后，誘導為中間絲蛋白陽性細胞，再用無血清的高糖DMEM誘導10小時后，得到胰島分泌細胞；(7)取出一部分從步驟(6)中得到的細胞，用RT PCR方法或免疫細胞化學方法檢測上述細胞是否為胰島分泌細胞。
2.如權利要求1所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特征 在于所述的步驟(1)是從正常足月剖腹產胎兒的胎盤的臍帶面，鈍性分離出的人羊膜組織。
3.如權利要求2所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特征 在于所述的步驟(2)為倒掉步驟(1)的生理鹽水，用溫度為4°C的含有100IU/ml青霉素和 100ug/ml鏈霉素混合液的生理鹽水對上述人羊膜組織進行清洗，直至人羊膜組織無任何雜 質和血漬后，在溫度為20 25°C的無菌間，用含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素的 D-hank' s沖洗上述人羊膜組織3-5遍后，放置在含100IU/ml青霉素和1000ug/ml鏈霉素 D-hank’ s液中浸泡2小時；2小時后用D_hank’ s液清洗3_5遍。
4.如權利要求3所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特征 在于所述的步驟(3)是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋白酶的消化液， 放入37°C水浴鍋中分兩次共消化45分鐘后，倒掉上述消化液，加入3ml的含10% FBS的 DMEM/F12液終止消化，將消化后的羊膜組織用D-hank’ s液清洗直至清洗液澄清為止。
5.如權利要求4所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特 征在于所述分兩次共消化45分鐘是將清洗后的人羊膜組織加入等體積的0. 25%胰蛋 白酶消化液，放入37°C水浴鍋中消化15分鐘后，倒掉上述消化液，然后再加入等體積的新 0. 25%胰蛋白酶消化液，放入37°C水浴鍋中消化30分鐘后，倒掉上述消化液，在消化時每 隔5分鐘晃動一次，使人羊膜組織被充分地消化。
6.如權利要求5所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特征 在于所述的步驟(4)中的將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質細胞是采取以下步 驟(I)將消化后的人羊膜組織用剪刀剪成漿狀后放入燒杯中，加入等體積的0.2%膠原 蛋白酶V，然后放入溫度為37°C的水浴鍋中消化20 30分鐘；(II)將消化后的羊膜漿狀液分別用60目細胞篩和200目細胞篩進行過濾，得到細胞懸 濁液；(III)用無血清DMEM/F12按1 1的比例稀釋上述過濾后細胞懸濁液，然后在室溫下 將其放入離心機內以2500r/min轉速離心10分鐘，10分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉， 然后再加入DMEM/F12，用吸管將細胞吹打均勻后，再將其放入離心機內以1500r/min轉速 離心5分鐘，5分鐘后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入10% FBS和DMEM/F12培養液后， 用吸管將細胞吹打均勻后，使人羊膜間充質細胞個數為1 X IO6個/ml-2X IO6個/ml。
7.如權利要求6所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特征 在于所述的步驟(5)是將步驟(4)得到人羊膜間充質細胞和含10% FBS的DMEM/F12培 養液放置在培養瓶中，培養瓶在溫度為36. 5-37. 5°C、飽和濕度、體積分數為4. 5%的CO2培 養箱中培養，每2-3天更換全部培養液，培養5-7天，觀察培養瓶中人羊膜間充質細胞融合 達到85%以上時，去掉培養液，用D-hank’ s液清洗兩遍后，再加2ml 0. 25%的胰蛋白酶消 化液進行消化，在消化過程中，用顯微鏡下觀察細胞的消化情況，當70%的細胞變化成圓形 時，立即加入2ml含10% FBS的DMEM/F12培養液終止消化，然后用力吹打培養瓶的壁，將 貼壁的細胞吹打下來；將回收的間充質細胞放入離心機內以1500r/min轉速每次離心5分 鐘，共計兩次，然后倒掉上清液，并計算細胞的個數；將上述回收的間充質細胞1 X IO6個/ ml-2X IO6個/ml的密度重復上述操作進行傳代接種培養，直至達到所需細胞數量。
8.如權利要求7所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特征 在于所述的步驟(7)的用RT-PCR方法是檢測上述細胞相關基因表達，若上述細胞包括 胰島素、葡萄糖轉運2、葡萄糖激酶、中間絲蛋白陽性細胞和胰腺和十二指腸同源盒細胞，說 明從步驟(6)得到的細胞為胰島分泌細胞，否則，說明從步驟(6)得到的細胞不是胰島分泌 細胞。
9.如權利要求7所述的將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，其特征 在于所述的步驟(7)的用免疫細胞化學方法是檢測上述細胞是否包括胰島素和C肽的 表達，若上述細胞包括胰島素和C肽的表達，說明從步驟(6)得到的細胞為胰島分泌細胞， 否則，說明從步驟(6)得到的細胞不是胰島分泌細胞。
全文摘要
本發明涉及一種將人羊膜間充質細胞誘導分化成胰島分泌細胞的方法，它包括從胎盤中分離出人羊膜組織；清洗上述人羊膜組織；消化清洗后的人羊膜組織；將上述人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質細胞；將人羊膜間充質細胞擴增到所需的數目后，用含有20％FBS的α-MEM的培養基調整到人羊膜間充質細胞的個數為1×105個/ml，然后將其接種到24孔板中，待8-12小時細胞貼壁后，加入20mmol/L尼克酰胺后，先用低糖的DMEM預先誘導24小時后，誘導為中間絲蛋白陽性細胞，再用無血清的高糖DMEM誘導10小時后，得到胰島分泌細胞，利用上述方法得到的胰島分泌細胞可以用于修復人體內的胰島組織。
文檔編號G01N33/53GK101914488SQ201010244938
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月4日 優先權日2010年8月4日
發明者劉艷軍, 劉穎, 吳亦芳, 張向利, 張紅霞, 曹克富, 李榮旗, 王月, 王瑞蘭, 肖靜, 范育紅, 郭麗麗, 郭敏 申請人:李榮旗