專利名稱：一種用atp合成酶鑒定腫瘤前期和腫瘤狀態的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，有關于鑒定哺乳動物腫瘤前期和腫瘤狀態的方法，尤其有關于一種根據ATP合成酶的差異性表達鑒定細胞和組織腫瘤形成前期和腫瘤形成的方法。
背景技術：
在進行腫瘤診斷時，常用的組織學染色劑是H&E(蘇木精和伊紅)染色，它們可差異性標記亞細胞成分。其它診斷方法還有采用針對細胞/組織中(通過細胞內表位)或細胞/組織表面(通過細胞外表位)的特定診斷性分子的抗體，再通過顯色反應使這些分子在顯微鏡下可見，以達到鑒別診斷的目的。
三磷酸腺苷合成酶，即ATP合成酶(Adenosine Triphosphate Synthase)主要是F1F0型ATP合成酶，由F1和F0兩個主要部分組成，F1在膜的外側，由5個不同的亞基組成，用化學計量法表示為α3β3γδε，包含3個結合位點，在每一個β亞基上。F0形成一個跨膜蛋白，由3個不同的亞基組成，化學計量法表示為a1b2c10-12。這個大分子蛋白復合體利用電子梯度和相關的膜電勢來合成ATP，也可以逆過程水解ATP來產生一個電子梯度(參見Pederson，P.L.，and L.M.Amzel.1993.《ATP synthases，Structure，reaction center，mechanism，andregulat ion of one of nature’s most unique machines》，《J.Biol.Chem.》，2689937.)。ATP合成酶主要存在于細菌的細胞膜、植物的葉綠體類囊膜和植物或動物的線粒體內膜上，在氧化磷酸化過程中催化ATP的合成。在人類內皮細胞的漿膜上也發現了F1F0型ATP合成酶。Das等研究發現ATP合成酶β亞單位表達于腫瘤細胞的細胞膜上，并且是淋巴細胞介導的細胞毒作用的配體，抗β亞單位處理將抑制NK細胞和LAK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用(參見Das，B.，Mondragon，M.O.，Sadeghian，M.，Hatcher，V.B.& Norin，A.J.《A novel ligand inlymphocytemediated cytotoxicityexpression of the beta subunit of H.transportingATPsynthase on the surface of tumour cell lines》，《J.Exp.Med.》，180，273-281(1994))。
越來越多的研究發現細胞膜上的ATP合成酶具有重要的功能，如血管內皮細胞胞膜上的ATP合成酶是抗血管因子(angiostatin)的受體(參見Moser，T.L.et al.《Angiostatinbinds ATPsynthase on the surface of human endothelial cells》，《Proc.Natl Acad.Sci.USA》，96，2811-2816(1999))，以及抗血管因子(angiostatin)與ATP合成酶結合而發揮其抗腫瘤作用(參見Moser，T.L.et al.《Endothelial cell surface F1-F0ATPsynthase is active in ATPsynthesis and is inhibited by angiostatin》，《Proc.NatlAcad.Sci.USA》，98，656-6661(2001))。
前列腺癌在歐美發病率極高，在高齡男性中僅次于肺癌，但在我國比較少見，近年發病率在增加。在西方國家中，前列腺癌的發生率正以驚人的速率增長，過去五年中，其增長超過1倍。在所有腫瘤中，它的發生率僅次于全世界男性癌癥死亡最常見病因的肺癌，是澳大利亞的第一位癌癥死亡病因。盡管這種情況很嚴重，但診斷方法卻很少，而且不夠精確。目前評估預后的方法，例如超聲波法、前列腺酸性磷酸酶水平法、雄激素剝奪法，前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)密度法、PSA速變法(參見Stamey，T.A.，N.Yang，A.R.Hay，J.E.McNeal，F.S.Freiha，and E.Redwine；1987，《Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of the prostate》《N.Engl.J.Med.》，317909-916.)、PSA年齡特異性參考范圍法以及Gleason組織病理學分級法都不能對前列腺癌的臨床結局提供可靠的預測信息。例如，研究顯示直腸指檢法的結果有36.9％假陰性率。前列腺特異性抗原是與前列腺外許多組織相關的一種33-kDa的絲氨酸蛋白酚，受雄激素、糖皮質激素和黃體酮的上調，據認為參與生長因子的調節。然而，血清前列腺特異性抗原水平的假陰性診斷率為23％，假陽性診斷率為36.7％，甚至有人提出超過半數的新篩檢病例實際上為假陽性。試圖通過引進其他的測試法，例如前列腺特異性抗原密度、速率以及年齡特異性參考范圍來改進篩檢方法結果也是不確定的。由于這種不確定性，常進行前列腺的活組織檢查來證實惡性，但這種檢測方法很不令人滿意，存在23％的假陰性診斷率，原因是未能直接采到發生癌變部位的樣品。
治療方法的選擇在很大程度上取決于根據組織切片顯微鏡分析得出的臨床階段。這種技術依賴于對組織學表現與臨床結局相關性的判斷和相當的經驗。然而，前列腺癌組織是異質性的，某些重要的診斷特征在切片檢查時很容易被忽略。同時，目前尚沒有檢驗外科手術或是放射治療結果的隨機并可控的試驗。可選擇的治療方法基本上包括有前列腺切除術、放射治療法、雄激素剝奪法和“觀測性等待”。“觀測性等待”對根治性干預問題的明確回答需等待前列腺癌干預對觀察試驗的結論。這些決定的結果對于病人而言往往非常嚴重，比如前列腺切除術法經常會導致小便失禁、膀胱頸狹窄、疼痛和消沉。
對于其他諸如乳腺癌或結腸癌等癌癥，采樣可能由于若干原因而被錯誤診斷。全球每年120萬婦女罹患乳腺癌，且有50萬死于該病。在西歐、北美等發達國家，乳腺癌的發病率占女性惡性腫瘤首位。據1992-1996年統計，美國每10萬人中就有110.6個人患有乳癌。而處于相低發區的中國，發病率更是呈逐年上升的趨勢。乳腺腫瘤，定位腫瘤的邊界可能不很明確(如果H&E染色判定)，組織學上明顯癌瘤和正常組織之間的邊界也是常常變化的，從而往往在腫瘤的周圍切下或多或少的會影響檢測的正常組織。
通過本發明，ATP合成酶可以容易地通過免疫組織化學方法而觀察到，并且已顯示它們存在各種各樣的表達模式，如細胞表面、線粒體和斑點標記。這些表達模式可以用于鑒定癌發展的不同階段，從完全正常組織開始，發展至腫瘤前期、腫瘤期。因此，本發明為診斷癌癥前期狀態(如增生)至癌癥階段，以及為研究癌癥發生的生理學和病因學提供了一種新方法。
本發明所述的ATP合成酶及其抗體，可以制作成試劑盒，單獨或聯合其他指標來診斷腫瘤，也可以ATP合成酶為靶標，開發治療性產品。
發明內容
本發明的主要目的在于提供一種鑒定腫瘤前期及/或腫瘤細胞的方法，該方法診斷精度高，可以將假陰性率降到非常低的水平。
本發明的另一目的在于提供一種鑒定腫瘤前期及/或腫瘤細胞的方法，該方法診斷判斷可靠性高并且簡單，不需要相當的經驗。
本發明的另一目的在于提供一種鑒定腫瘤前期及/或腫瘤細胞的方法，該方法可以對異質性的癌組織進行隨機和可控制的檢驗，從而提高切片檢查結果的可信度。
為了達成上述目的，本發明提供一種鑒定哺乳動物腫瘤前期和腫瘤狀態的方法，其特征是包括有下列步驟a.用抗原免疫動物，獲得目標抗體；b.使用哺乳動物細胞、組織，制作細胞芯片和組織切片；c.利用免疫組化方法，使用步驟a制備的抗體檢測ATP合成酶在組織和細胞中的表達情況；以及，d.確定哺乳動物細胞及/或組織的ATP合成酶表達圖，并通過判斷標準對結果進行定性。
圖1為前列腺癌前期ATP合成酶的表達照片。
圖2為前列腺癌組織ATP合成酶的表達照片。
圖3為乳腺癌前期ATP合成酶的表達照片。
圖4為乳腺癌組織ATP合成酶的表達照片。
圖5為結腸癌前期ATP合成酶的表達照片。
圖6為結腸癌組織ATP合成酶的表達照片。
圖7為肝癌前期ATP合成酶的表達照片。以及，圖8為肝癌組織ATP合成酶的表達照片。
具體實施例方式
本發明提供了一種鑒定哺乳動物腫瘤前期和腫瘤狀態的方法，更確切的是通過檢測ATP合成酶，為鑒定哺乳動物腫瘤前期和腫瘤狀態的各階段提供了一種方法，該方法也可用于確定哺乳動物癌發生的病因學。確定的ATP合成酶及其抗體，可以制作成試劑盒，單獨或聯合其他指標來診斷疾病，也可以ATP合成酶為靶標，開發治療性產品。
本方法是通過以下步驟實現的a.用抗原免疫動物，獲得目標抗體；b.使用哺乳動物細胞、組織，制作細胞芯片和組織切片；c.利用免疫組化方法，使用步驟a制備的抗體檢測ATP合成酶在組織和細胞中的表達情況；以及，d.確定哺乳動物細胞及/或組織的ATP合成酶表達圖，并通過判斷標準對結果進行定性。
步驟a所述的抗體可按下面文獻中所揭露的方法制備Chang，S.Y.，Park，S.G.，Kim，S.，and Kang，C.-Y.，《Interaction of the C-terminal Domain of p43 and theαSubunitof ATPSynthase.ITS FUNCTIONAL IMPLICATION IN ENDOTHELIAL CELL PROLIFERATION》，《J.Biol.Chem.》，Mar 2002；2778388-8394。該抗體須為能鑒別腫瘤前期或腫瘤細胞和P P/或組織與正常細胞及/或組織的ATP合成酶的特異性抗體，如對于ATP合成酶α亞單位和ATP合成酶β亞單位為特異性的抗體。ATP合成酶特異性抗體是多克隆和單克隆抗體。抗體是一組抗體。該抗體用于分離哺乳動物細胞或組織。
步驟b中所使用的哺乳動物即可以是人類，也可以是馬、牛、羊、狗、貓、大鼠和小鼠等任何一種哺乳動物。細胞及/或組織可以用任何方法獲得，比如從活組織檢查中得到，例如通過細針抽取，特別是從乳腺組織中抽取，從體液中獲得；如果是前列腺細胞及/或組織，則可從直腸指檢滲出物或精液中獲得。組織可以為石蠟包埋的組織和冰凍組織中的一種。細胞可以是上皮細胞、內皮細胞中的任何一種；組織可以是前列腺、乳腺、結腸、直腸、肺、肝臟、腎臟中的任何一種。
在較佳實施例中的步驟b中，在較佳實施例中的步驟b中，腫瘤組織通過手術獲得。手術組織大小為2.0×1.5×0.5立方厘米，獲得標本經40g/L甲醛固定(formalin fixed)，常規石蠟包埋，4μm切片，裱片，烤片。
為了驗證實驗結果，我們收集20份新鮮正常前列腺組織、40份前列腺癌前病變組織和40份新鮮前列腺癌組織，大小為2.0×1.5×0.5立方厘米，標本經40g/L甲醛固定，常規石蠟包埋，4μm切片，HE染色，鏡下選擇不同程度的病變包括癌前病變組織和癌組織，在供體蠟塊上定位標記打孔靶位。可以使用組織芯片儀MTA-1(Manual TissueArrayer，Beecher Instrument，Silver Spring，MD)針吸組織直徑為0.6mm，靶位間距1.0mm.為防止脫片每靶位組織重復裝載一次。制成10×20陣列。最后將受體蠟塊進行4μm連續切片，進行常規HE染色和免疫組化染色。根據本發明的原理，在該步驟中所收集的組織也包括來自乳腺，結腸、肝癌等。
步驟c所述的免疫組化方法可以是酶聯免疫吸附(ELISA)、放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)、免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)、免疫印跡(Western blotting)和Northern blotting。IHC包括ABC法、S-P法、Envision法以及DAB(二氨基聯苯胺)和LSAB(標記的鏈霉親和素生物素技術)免疫酶聯方法。
在較佳實施例的步驟c中，可用如下方法對抗ATP合成酶進行前列腺石蠟組織芯片的免疫組化檢測。
c.a.脫蠟水化脫蠟前將組織芯片放在60恒溫箱中烘烤30分鐘，置于二甲苯I中浸泡10分鐘，在二甲苯II中再浸泡10分鐘；無水乙醇I中浸泡5分鐘，在無水乙醇II中再浸泡5分鐘，95％乙醇中浸泡5分鐘，85％乙醇中浸泡5分鐘，70％乙醇中浸泡5分鐘。
c.b.蒸餾水中洗5分鐘c.c.用蒸餾水或PBS配置新鮮的3％H2O2，室溫封閉5-10分鐘，蒸餾水洗1次。
c.d.抗原修復c.d.a.高溫高壓熱修復取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)，于壓力鍋中大火加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織芯片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋扣上壓力閥繼續加熱至噴氣從噴氣開始計時，1-2分鐘后壓力鍋離開熱源冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水洗兩次后用PBS洗5分鐘。
c.d.b.微波熱修復取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)，于微波盒中微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織芯片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中高檔繼續處理10-15分鐘。取出微波盒冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水洗兩次后，用PBS洗5分鐘。
c.d.c.酶消化方法常用0.1％胰蛋白酶和0.4％胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘。胃蛋白酶消化，37℃，10-30分鐘。
e.PBS洗5分鐘。
f.滴加正常山羊血清封閉液，室溫10-20分鐘，甩去多余液體。
g.滴加1∶100稀釋的抗ATP合成酶，室溫1小時或者4過夜，過夜后在37℃復溫30分鐘。
h.PBS洗2次，每次5分鐘。
i.滴加1∶100稀釋的HRP-偶聯的山羊抗小鼠第二抗體(Dako)，對家兔第一抗體為HRP-偶聯的抗兔第二抗體酶標二抗，室溫孵育30分鐘。
j.PBC洗2次，每次5分鐘。
k.滴加DAB顯色液，鏡下掌握顯色程度。
l.蒸餾水洗終止染色。蘇木素復染，鹽酸酒精分化。
m.脫水、透明、封片、鏡檢。
對照切片與第一次培育稀釋緩沖液一起培育，之后用與實驗切片相同的方式進行處理。除了第一抗體用非免疫血清替代外，陰性對照切片用與實驗切片相同的方式進行處理。證實了所有抗體的獨特特異性。
步驟d所述的ATP合成酶表達圖是ATP合成酶α亞單位和ATP合成酶β亞單位表達圖。ATP合成酶表達圖包括正常、癌前期、腫瘤階段組織和細胞的ATP合成酶表達圖。步驟d所述的判斷標準是指那些能夠在腫瘤前期或腫瘤細胞/組織與正常細胞/組織相比，在表達圖強度的差異上產生最大對比的蛋白。表達強度按未著色、淺黃色、淺棕色和深棕色逐漸增強。該判斷標準在用于腫瘤前期和腫瘤狀態的診斷指標時，具體標準為腫瘤前期或腫瘤狀態時，與正常的前列腺細胞或組織的表達圖相比，其前列腺細胞或組織中的ATP合成酶表達圖強度增強，即定義為存在癌癥前期或癌癥的診斷指標。
在較佳實施例中，圖1、2所示為對人前列腺癌組織和正常組織或良性前列腺中的ATP合成酶表達進行的差異判斷。對該20個正常前列腺組織、40例前列腺癌前病例和40例前列腺癌病例的研究中，人前列腺癌組織中的ATP合成酶顯著增加，本領域的技術人員可以判斷，胞漿或胞膜棕褐色顆粒為陽性。正常組織或良性前列腺增生沒有可見的標記，胞漿和胞膜未見棕褐色顆粒為陰性。實驗證明使用本發明方法前列腺癌的ATP合成酶表達陽性率約為75％，高于正常前列腺組織的17.5％和前列腺癌前病例的22.5％，差異有顯著性(P小于0.05％)。
根據本發明的原理，在該步驟中也可以使用抗ATP合成酶進行乳腺、結腸、肝臟等組織石蠟組織芯片的免疫組化檢測。圖3、4所示為對人乳腺癌組織和正常組織或良性乳腺中的ATP合成酶表達進行的差異判斷。實驗證明使用本發明方法乳腺癌的ATP合成酶表達陽性率約為90％，高于正常乳腺組織的10％和乳腺癌前病例的17.5％，差異有顯著性(P小于0.05％)。圖5、6所示為對人結腸癌組織和正常組織或良性結腸中的ATP合成酶表達進行的差異判斷。實驗證明使用本發明方法結腸癌的ATP合成酶表達陽性率約為90％，高于正常結腸組織的17.5％和結腸前病例的25％，差異有顯著性(P小于0.05％)。圖7、8所示為對人肝癌組織和正常組織或良性肝癌中的ATP合成酶表達進行的差異判斷。實驗證明肝癌的ATP合成酶表達陽性率約為82.5％，高于正常肝組織的17.5％和肝癌前病例的27.5％，差異有顯著性(P小于0.05％)。參照前面所述的免疫組化檢測方法，用抗ATP合成酶進行石蠟組織芯片的免疫組化檢測，組織胞漿或胞膜呈現棕褐色顆粒可初步為腫瘤陽性，在結合其他臨床方法作出最后診斷。
本發明的方法和ATP合成酶特異性抗體可以與其他互補性檢測方法例如腫瘤惡性試驗方法聯用，檢測和診斷腫瘤。腫瘤惡性試驗可以采用針對人端粒酶蛋白質(hTP1)的特異性抗體進行抗端粒酶抗體測試，或者任何其他適當的試驗，例如抗肌腱蛋白試驗。
本發明的ATP合成酶及其特異性抗體也可應用于疾病治療過程之中的癌癥檢測和監測。
在本發明上下文中所述及的“腫瘤細胞”和“腫瘤組織”術語，按其普通含義理解，包括但不限于具有腫瘤細胞或組織特征的細胞或組織，例如，增生或肥大性生長模式以及被蘇木精和伊紅染料(即H&E)特征性著染突現異常的細胞形狀大小和細胞核大小。
在本發明上下文中所述及的“腫瘤前期細胞”和“腫瘤前期組織”術語，按其普通含義理解，包括但不限于增生或肥大性生長的細胞或組織。但是所述的細胞或組織并沒有腫瘤細胞或組織的特征，例如被H&E特征性著染的腫瘤細胞或組織突現異常的細胞形狀大小和細胞核大小。
在本發明上下文中所述及的“正常細胞”和“正常組織”的術語，按其普通含義理解，包括但不限于與既沒有腫瘤前期形成也沒有腫瘤形成的個體的細胞的ATP合成酶(相比)沒有可見的實質性改變的細胞或組織。在本發明上下文中所述及的與前列腺狀態相關的“正常細胞”術語還包括從良性前列腺增生的前列腺獲得的細胞。
在本發明上下文中所述及的“一組抗體”術語包含多克隆抗體，其含有對相同或不同抗原具有特異性的幾種不同抗體而能特異性辨別各種受體亞型。當此抗體為單克隆抗體時，“一組抗體”還包括能夠特異性辨別每種ATP合成酶如α亞單位和β亞單位的抗體組。在本發明上下文中所述及的“表達圖譜”的測定，包括表達模式或強度的測定。
如本技術領域的人所知，本發明的附圖和實施例僅為說明本發明的功能、結構和原理而不應當成為對本發明理解上的限制；同時，本發明的目的均已經實現。上述實施例可能在不脫離本發明原理的情況下有所變更，故此，本發明的保護應以權利要求書中所描述的范圍為準。
權利要求
1.一種鑒定哺乳動物腫瘤前期和腫瘤狀態的方法，其特征是包括有下列步驟a.用抗原免疫動物，獲得目標抗體；b.使用哺乳動物細胞、組織，制作細胞芯片和組織切片；c.利用免疫組化方法，使用步驟a制備的抗體檢測ATP合成酶在組織和細胞中的表達情況；以及，d.確定哺乳動物細胞及/或組織的ATP合成酶表達圖，并通過判斷標準對結果進行定性。
2.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳動物是人類。
3.根據權力要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述抗體是單克隆抗體。
4.根據權力要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述抗體是多克隆抗體。
5.根據權力要求1所述的方法，其特征在于步驟b中所述組織是石蠟包埋組織。
6.根據權力要求3所述的方法，其特征在于步驟b中所述組織是石蠟包埋組織。
7.根據權力要求4所述的方法，其特征在于步驟b中所述組織是石蠟包埋組織。
8.根據權力要求1所述的方法，其特征在于步驟b中所述組織是冰凍組織。
9.根據權力要求2所述的方法，其特征在于步驟b中所述組織是冰凍組織。
10.根據權力要求3所述的方法，其特征在于步驟b中所述組織是冰凍組織。
11.根據權力要求4所述的方法，其特征在于步驟b中所述組織是冰凍組織。
12.根據權力要求1所述的方法，其特征在于步驟b中所述的組織和所述的細胞是上皮組織和上皮細胞。
13.根據權力要求2所述的方法，其特征在于步驟b中所述的組織和所述的細胞是上皮組織和上皮細胞。
14.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞是內皮組織和內皮細胞。
15.根據權力要求2所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞是內皮組織和內皮細胞。
16.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自前列腺。
17.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自乳腺。
18.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自結腸。
19.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自肝臟。
20.根據權力要求2所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自前列腺。
21.根據權力要求2所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自乳腺。
22.根據權力要求2所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自結腸。
23.根據權力要求2所述的方法，其特征在于所述步驟b中所述的組織和所述的細胞來自肝臟。
24.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟d中所述的ATP合成酶表達圖是ATP合成酶α亞單位的表達圖。
25.根據權力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟d中所述的ATP合成酶表達圖是ATP合成酶β亞單位的表達圖。
26.根據權力要求2所述的方法，其特征在于所述步驟d中所述的ATP合成酶表達圖是ATP合成酶α亞單位的表達圖。
27.根據權力要求2所述的方法，其特征在于所述步驟d中所述的ATP合成酶表達圖是ATP合成酶β亞單位的表達圖。
全文摘要
本發明涉及一種鑒定腫瘤前期及/或腫瘤細胞的方法，該方法包括有下列步驟a.用抗原免疫動物，獲得目標抗體；b.使用哺乳動物細胞、組織，制作細胞芯片和組織芯片；c.利用免疫組化方法，使用步驟a制備的抗體檢測ATP合成酶在組織和細胞中的表達情況；以及，d.確定哺乳動物細胞及/或組織的ATP合成酶表達圖，并通過判斷標準對結果進行定性。該方法診斷精度高，可以將假陰性率降到非常低的水平，診斷判斷可靠性高并且簡單，不需要相當的經驗，并可以對異質性的癌組織進行隨機和可控制的檢驗，從而提高切片檢查結果的可信度。
文檔編號G01N33/531GK1877333SQ20051002650
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月6日 優先權日2005年6月6日
發明者倪健, 彭艷, 楊子義, 羅鵬 申請人:上海富純中南生物技術有限公司