基于微柱陣列型拓撲結構基底的培養皿裝置及其在增強靶標響應性中的應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種基于微柱陣列型拓撲結構基底的培養皿 裝置及其在增強靶標響應性中的應用方法。
【背景技術】
[0002] 細胞的體外培養是生命科學基礎研宄、組織工程、藥物篩選和毒物評價以及細胞 生物傳感器構建等的重要研宄內容。傳統的平面基底細胞培養法的局限性已經為學術界和 生物技術產業界所熟知。近二十余年，隨著組織工程學、空間微重力技術、微電子技術的發 展及與生物技術的結合，細胞三維培養和細胞培養微環境的工程化構建越來越成為醫學及 生物工程關注的領域。細胞微環境工程化構建的目的，其一是模擬體內三維微環境，實現組 織植入體的構建并優化組織細胞功能表型以達到組織工程或再生醫學的臨床應用目的；其 二是通過培養微環境設計增強放大某一表型或靶標響應性，從而為細胞工程產品的制備或 基于細胞（或組織）的藥物篩選或毒物評價服務。在基于細胞的藥物篩選或毒物評價中， 細胞作為傳感器被培養在特定的基底上，細胞的特定成分（如受體、通道和酶等）作為特定 的靶標而與藥物或毒物成分相互作用，靶標的響應性將作為藥效或毒理作用的判斷依據。 在這一篩選體系中，培養細胞的靶標響應質量（生理或病理相關性）及相應強度是決定篩 選效益（如前導化合物質量、假陽性率或假陰性率）以及篩選通量的最重要的因素。有鑒 于熒光檢測是目前基于細胞的高通量或高內涵篩選中最為重要的檢測手段，采用特定的手 段提高細胞的藥物或毒物靶標質量、增強靶標的熒光響應強度成為目前相關細胞篩選體系 的重要研宄內容。例如，短暫受體電位（TRP)家族通道是體內存在于多種細胞的（鈣）離 子通道，與多種信號在細胞的整合有關。在肝臟，這些通道是一些重要肝臟疾病如膽汁淤積 等藥物治療的潛在靶標。其中，TRPVl通道在眾多的膜片鉗研宄中被發現具有快速去敏感 化特性。然而，采用鈣離子熒光記錄的方法發現，在TRPVl激動劑加入后期鈣離子信號響應 峰寬往往達數分鐘至十分鐘以上。可以預見，在這種篩選體系下的篩選效果和所得前導化 合物的質量將明顯受到影響。同理，采用適當的手段，如能增強有關靶標的熒光相應幅度， 將是提高篩選速度或通量的有效途徑。這里，基因工程手段可能是選項之一。然而，基因工 程方法面臨改變傳感器細胞遺傳環境和細胞表型的缺陷，其生理/病理相關性可能受到質 疑。非基因工程的增強靶標響應性的方法具有明顯的應用前景。
[0003] 按照近年有關研宄進展，細胞培養微環境構建包括以下微環境要素的控制：（1) 化學和生物化學組成；（2)空間（幾何三維形式）和時間因素；（3)力學因素及基底物理 特性。其中，細胞培養基底物理特性的工程化構建是特別值得有關的研宄與開發。這是 因為，一旦某一特性基底的應用得以明確，它將很容易實現批量制備與產業化應用。在這 里，基底拓撲結構也是最容易批量制備和產業化應用的細胞培養微環境要素。在過去十余 年，已經有類似的細胞培養皿產品出現在市場上，如Glycosan公司的Extracel?水凝膠、 Invitrogen 公司的 AlgiMatrix?、Glycosan 的 Extracel?海綿、Corning 公司的 Ultra-Web 以及3D Biotek的3D Insert等。然而，這類產品的一個重要局限是未能對相關適用革巴標 范圍有明確的定義或建議。目前也未見使用這類培養裝置增強靶標響應質量或提高前導物 篩選效能或通量的報道。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于微柱陣列型拓撲結構基底的培養皿裝 置及其在增強靶標響應性中的應用方法，該培養皿的基底含微柱陣列結構，該微柱陣列結 構能支持所培養細胞的粘附及鋪展，以及維持均一的細胞特性；進一步，在所建立的含微柱 陣列結構基底的培養皿上，檢測離子通道的響應性，進而建立一種增強細胞離子通道靶標 響應性的檢測方法。
[0005] 為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0006] 一種基于微柱陣列型拓撲結構基底的培養皿裝置，包括：細胞培養皿本體、培養皿 板蓋、具有拓撲結構基底的細胞培養池、細胞培養池固定并覆蓋在細胞培養皿本體上；在培 養皿板蓋上設置有加藥窗口，其中加藥窗口位于培養皿板蓋的中心；
[0007] 所述細胞培養池包括固定外框和培養孔板，所述培養孔板采用拓撲結構基底；所 述固定外框的尺寸與培養皿本體相對應，在固定外框的中部設置凹槽拓撲結構基底培養 區，所述凹槽培養區用于放置具有拓撲結構的基底，所述固定外框的邊緣上還設置有培養 液進液口和培養液出液口，進液管和出液管采用可拆卸固定的方式通過進液口和出液口安 插在細胞培養池上。
[0008] 進一步，所述培養液進液口和培養液出液口在靠近培養平面的內側設置有緩沖臺 階，以保證細胞及其生長所需營養液在腔內均勻分布。
[0009] 進一步，所述拓撲結構基底的培養孔板采用陣列排列的多個縱橫相互平行的微 柱。
[0010] 進一步，所述加藥窗口能夠實現密封，采用緊扣的方式設置在培養皿蓋板上，通過 加藥窗口能夠實現一次性注射式加藥。
[0011] 進一步，進液管和出液管均可安裝閥門，可在操作需要時開啟閥門，用于進出液或 是灌流式加藥。
[0012] 進一步，所述進液口與出液口設有密封墊圈。
[0013] 進一步，微柱陣列基底、細胞培養池均為透明材質結構。
[0014] 一種應用上述培養皿裝置增強靶標響應性的方法，包括以下步驟：
[0015] 步驟一：培養皿的預處理：用裱襯液對所述的培養皿進行裱襯，得預處理后的培 養皿；
[0016] 步驟二：細胞靶標響應性功能的增強：將靶細胞在預處理后的培養皿中培養至少 72小時，并施以激動劑刺激得TPPVl和TRPV4鈣離子通道功能響應性增強的靶細胞。
[0017] 一種應用上述培養皿裝置在增強細胞鈣內流響應性的方法，包括以下步驟：
[0018] 步驟一：培養皿的預處理：用裱襯液對所述的培養皿的基底進行裱襯，裱襯時間 至少為2小時，得預處理后的培養皿；
[0019] 步驟二：細胞培養：將細胞接種于經步驟A預處理后的培養皿；
[0020] 步驟三：細胞TRPV離子通道鈣內流熒光響應性的增強：微柱陣列拓撲結構培養皿 中培養的細胞先經鈣離子熒光染料染色后，以普通熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、孔板讀 數器或其他鈣離子熒光記錄裝置采集細胞鈣離子熒光信號，在信號采集過程中施以TRPV 激動劑刺激，得鈣瞬態內流的離子通道熒光響應性。
[0021] 本發明的有益效果在于：本培養皿采用采用微柱陣列型拓撲結構作為細胞培養基 底，其微柱直徑為微米或納米級，制備的微柱陣列可以達到0.1 Ocm2到Icm2的大面積范圍， 達到培養皿應用的要求，其生產成本低，操作簡單；本培養皿不僅增強細胞TRPVl和TRPV4 在mRNA和蛋白水平的表達，而且增強上述兩種通道在激動劑作用下的熒光響應強度。在培 養皿腔體及蓋板的設計上，本發明設計的加樣管或窗口包括了連續性灌流和一次性注射加 樣兩種加樣方式，具有多種實際用途。其中，一次性注射加樣對于實現快速去敏感化通道較 好的靶標響應質量具有明顯的方法性保證。從而構建一種更好的細胞培養微環境且利于優 化細胞功能，同時可為快速檢測藥物響應情況提供了新方法和思路。
【附圖說明】
[0022] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行 說明：
[0023] 圖1為細胞培養皿結構示意圖；