月桂酸修飾超氧化物歧化酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種超氧化物歧化酶修飾技術，特別是涉及一種月桂酸修飾超氧化物 歧化酶的制備方法。
【背景技術】
[0002] 超氧化物歧化酶（SOD)由于受到半衰期短、相對分子質量大、不易透過細胞膜、口 服時易受胃蛋白酶分解、體內特異性等因素的限制，SOD很難作為藥用酶廣泛應用于臨床 中。對SOD進行化學修飾，既能保留天然酶的活性，又能提高其穩定性，同時在耐熱、耐酸堿 和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。中國專利CN101323845A和CN103805588A分別公 開了月桂酰氯修飾超氧化歧化酶的制備方法和月桂酸修飾超氧化歧化酶的制備方法，而如 何進一步提尚廣品活性和收率是需要解決的問題。
【發明內容】
[0003] 針對上述現有技術的不足，本發明的目的是提供一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶 的制備方法以提高月桂酸修飾超氧化物歧化酶的活性和收率。
[0004] 本發明的技術解決方案是：一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的制備方法，包括以 月桂酸和氯化亞砜為原料，以吡啶DMF為催化劑進行催化反應得到月桂酰氯；在40~48°C 的堿性條件下，用月桂酰氯與超氧化物歧化酶進行酰基化反應；對酰基化反應物過濾后取 上清液I通過3~6級的溫度梯度處理，所述3~6級的溫度梯度處理為初始溫度為40~ 45°C，每級溫差為5~KTC，末級處理的低溫為5~KTC，其中首級溫度梯度處理是將上清 液I由初始溫度迅速冷卻至初始溫度減去每級溫差后的低溫，并保持10~15分鐘后迅速 升溫至初始溫度進行3500~4500轉/分鐘離心10~30分鐘，除去沉淀取上清液，后續 每級溫度梯度處理是將前一級上清液由前一級處理后溫度迅速冷卻至前一級處理后溫度 減去每級溫差后的低溫，并保持10~15分鐘后迅速升溫至前一級處理的低溫進行3500~ 4500轉/分鐘離心10~30分鐘，除去沉淀取上清液，對末級處理后的上清液II進行2級沉 淀滅菌提純處理得到月桂酸修飾超氧化物歧化酶。
[0005] 所述2級沉淀滅菌提純處理為對上清液II加入1~5倍體積的低于-10°C的無水 乙醇，充分攪拌，3500~4500轉/分鐘離心5~15分鐘，棄上清液，將沉淀溶于2~5倍體 積的無菌水中，充分溶解后，重復上述操作，留取沉淀。
[0006] 所述催化反應包括如下步驟：將月桂酸：氯化亞砜體積重量比為100mL:6~7g 的月桂酸和氯化亞砜加入到反應器中并按月桂酸：吡啶DMF體積比100 : 4~5添加催化 劑吡啶DMF，加熱至90~93°C，攪拌反應1~2小時，再回流1~2小時，回流結束，讓反應 物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146~150°C的餾分，得到月桂酰氯。
[0007] 所述的酰基化反應包括如下步驟：超氧化物歧化酶按照重量體積比Ig: 50~ 500ml溶于pH為8. 0~9. 2磷酸鉀緩沖液中，緩慢滴加月桂酰氯，超氧化物歧化酶溶液與月 桂酰氯摩爾比為1 : 80~3000 ;充分攪拌后，滴加0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，調節超氧化 物歧化酶溶液的pH值為8.O~9. 2,pH在30分鐘內穩定不變化為止；將上述溶液放置于 40~48°C的水浴中攪拌1~1. 5小時。
[0008] 所述超氧化物歧化酶溶液的pH值為8. 8。
[0009] 本發明所的有益效果是用該方法得到的月桂酸修飾的超氧化物歧化酶的活性和 收率都較現有技術有提高；月桂酸修飾的超氧化物歧化酶相比超氧化物歧化酶在耐熱、耐 酸堿和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。本發明具有工藝簡單、周期短、收益率高，具 有較高的社會經濟效益。
【具體實施方式】
[0010] 下面結合實施例對本發明作進一步說明，但不作為對本發明的限定。
[0011] 實施例1
[0012] 將250ml月桂酸、17g氯化亞砜和12ml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱 至93°C，攪拌反應2小時，再回流2小時，回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯 化亞砜，收集146~150 °C的餾分得到月桂酰氯；稱取超氧化物歧化酶50g溶于5000ml的 pH8. 5磷酸鈉緩沖液中，充分溶解；向酶溶液中緩慢滴加月桂酰氯200ml，充分攪拌反應后， 滴加0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，維持酶溶液的pH值為8. 8,直至酶溶液的pH維持在8. 8， pH在30分鐘內穩定不變化為止，停止滴加氫氧化鈉。
[0013] 將上述溶液放置于40°C的水浴中攪拌60分鐘，使酰化反應充分進行；抽濾除去沉 淀，取上清液I。
[0014] 溫度梯度處理：對上清液I進行3級溫度梯度處理，初級溫度為40°C，終極溫度為 KTC，每一級間溫度梯度差為KTC，上清液I由40°C迅速降至30°C，保持10分鐘后再迅速 升至40°C，4000轉/分鐘離心20分鐘，除去沉淀，再迅速降溫至20°C，保持10分鐘后再迅 速升至30°C，4000轉/分鐘離心20分鐘，除去沉淀，再迅速降溫至KTC，保持10分鐘后再 迅速升至20°C，4000轉/分鐘離心20分鐘，除去沉淀，得到上清液II。
[0015] 對上清液II進行二級乙醇沉淀滅菌：加入3倍體積的-12°C的無水乙醇，充分攪 拌，即產生白色沉淀，4000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清液，將沉淀溶于4倍體積的無菌水 中，充分溶解后，重復上述操作，留取沉淀約40g左右。
[0016] 用250ml的50mmol/LpH= 6. 2的磷酸鈉緩沖液溶解沉淀，即得月桂酸修飾的超 氧化物歧化酶溶液，凍干后得到凍干粉約30g。
[0017] 實施例2
[0018] 將100mL月桂酸、6g氯化亞砜和4ml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至 90°C，攪拌反應1小時，再回流1小時，回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯 化亞砜，收集146~150°C的餾分，得到月桂酰氯；稱取超氧化物歧化酶50g溶于8000ml的 pH8. 7磷酸鈉緩沖液中，充分溶解；向酶溶液中緩慢滴加月桂酰氯50ml，緩慢滴加，充分攪 拌反應后，滴加0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，維持酶溶液的pH值為9. 0,直至酶溶液的pH維 持在9. 0,pH在30分鐘內穩定不變化為止，停止滴加氫氧化鈉。
[0019] 將上述溶液放置于45°C的水浴中攪拌80分鐘，使酰化反應充分進行；過濾除去沉 淀，取上清液I。
[0020] 溫度梯度處理：對上清液I進行5級溫度梯度處理，初級溫度為45°C，終極溫度為 5°C，每一級間溫度梯度差為8°C，上清液I由45°C迅速降至37°C，保持15分鐘后再迅速升 至45°C，3500轉/分鐘離心30分鐘，除去沉淀，再迅速降溫至29°C，保持15分鐘后再迅速 升至37°C，3500轉/分鐘離心30分鐘，除去沉淀，再迅速降溫至21°C，保持15分鐘后再迅 速升至29°C，3500轉/分鐘離心30分鐘，除去沉淀，再迅速降溫至13°C，保持15分鐘后再 迅速升至21°C，3500轉/分鐘離心30分鐘，除去沉淀，再迅速降溫至5°C，保持15分鐘后再 迅速升至13°C，3500轉/分鐘離心30分鐘，除去沉淀，得到上清液II。
[0021] 對上清液II進行二級乙醇沉淀滅菌：加入5倍體積的-KTC無水乙醇，充分攪拌， 產生白色沉淀，低速4500轉/分鐘離心5分鐘，棄上清液，將沉淀溶于5倍體積的無菌水中， 充分溶解后，重復上述操作，留取沉淀約50g左右。
[0022] 用350ml的50mmol/LpH= 6. 3的磷酸鈉緩沖液溶解沉淀，即得月桂酸修飾的超 氧化物歧化酶溶液，凍干后得到凍干粉約40g。
[0023] 實施例3
[0024] 將200ml月桂酸、13g氯化亞砜和IOml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱 至91°C，