一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，本方法包括以下步驟：將月桂酸、氯化亞砜和催化劑置于反應器中加熱反應，反應結束后蒸餾得到活化后的月桂酸；將牛血Cu/Zn-SOD溶于弱堿性緩沖液中，再加入活化的月桂酸，升溫，攪拌60min后濃縮降溫，再加入無水乙醇，離心，洗滌后再離心，用透析器透析，收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶。采用本方法修飾的月桂酸超氧化物歧化酶，具有酶回收率達到90%以上，無任何有害物質殘留，且穩定性高的優勢。
【專利說明】一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛋白酶化學修飾【技術領域】，尤其涉及一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法。
【背景技術】
[0002]超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,簡稱S0D),是一種廣泛存在于自然界動植物以及一些微生物體內的金屬酶，是生物抗氧化酶類的重要成員，它能夠清除生物氧化過程中產生的超氧陰離子自由基(02_)，是生物體有效清除活性氧的重要酶類之一，被稱為生物體抗氧化系統的第一道防線。它以超氧陰離子作為底物并催化其發生歧化反應，從而清除對機體有害的超氧自由基。其催化機理如下:
[0003]SOD (氧化型)+02_——S0D—(還原型)+O2
[0004]SOD^ (還原型)+02_——SOD (氧化型)+H2O2
[0005]總反應:20o>2H+S0D酶 0。+扎0。
[0006]當機體產生多余的超氧自由基且不能被及時清除時，就會引起機體疲勞，加速衰老同時誘發各種疾病。自由基學說認為:自由基具有高度的化學活性，是人體正常代謝的中間產物，可損害生物膜，是多種疾病產生、發展的根源。SOD作為機體內最重要的抗氧化酶體之一，可以直接清除過量的超氧自由基，阻止機體的過氧化，對機體有較高的防護作用及保健價值。由于超氧化物歧化酶的抗氧化作用，它已經被廣泛的應用于醫療、化妝品及其它化工領域。
[0007]由于SOD受到半衰期短、相對分子質量大、不易透過細胞膜、口服時易受胃蛋白酶分解、體內特異性等因素的限制，很難廣泛應用，因此必須對蛋白進行化學修飾。一般利用水溶性大分子如聚乙二醇、蔗糖、右旋糖肝和聚烯屬烴基氧化物等對SOD進行共價修飾。但是由于上述物質的分子量較大，修飾后的蛋白具有很強的免疫原性，雖然酶學穩定性得到了很大的提高，但是仍然很難被人體所利用。而月桂酸修飾的超氧化物歧化酶(LA-SOD)則克服上述的問題，月桂酸與SOD分子表面的氨基作用，月桂酸表面疏水基團的引入，增加了酶表面的疏水性，遮蓋了酶對熱、酸、堿、有機溶劑及蛋白水解酶敏感的易伸展位點，因而大大地加強了酶的穩定性。同時，小分子的月桂酸疏水基團的引入還能掩蓋酶分子的抗原決定簇，去除其免疫原性，更重要的是疏水基團對細胞膜和脂雙層具有高度的親和性，使大分子酶的透皮吸收有了理論基礎。
[0008]但是現有的月桂酸修飾超氧化物歧化酶的技術卻大都存在著回收率低、有害物質殘留和穩定性差等一系列問題，嚴重限制了月桂酸修飾超氧化物歧化酶的工業應用。
【發明內容】
[0009]本發明的目的就是解決現有技術中月桂酸修飾超氧化物歧化酶的技術回收率低、有害物質殘留和穩定性差等問題，提供一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法。
[0010]為實現該技術效果，本發明提供了如下的技術方案:[0011]一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，該方法包括以下步驟:
[0012](1)將100~200ml月桂酸、5~15g氯化亞砜和5~IOml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至90~95°C，攪拌反應I~3小時，再回流1~3小時，
[0013](2)回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146~150°C的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末，置于冰箱中保存，
[0014](3)取150~250g濃度為4500U/mg的牛血Cu/Zn-SOD溶于15-20L弱堿性緩沖液中，在20°C下攪拌溶解，邊攪拌邊加入40~60ml活化的月桂酸，然后升溫至40°C，攪拌60min后，將溶液濃縮至2000~3000ml，然后迅速降溫至室溫，
[0015](4)加入3倍體積量的-18°C的無水乙醇，用轉速為4000r/min進行離心，收集沉淀，將沉淀溶解于1500~2500ml的雙蒸餾水，再用4500r/min的轉速進行離心，除去不溶物，取上清液通過中空纖維透析器，兌蒸餾水透析，透析液預先用緩沖液平衡好的層析柱層析1.5-2.5小時，最后收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶(LA-SOD)。
[0016]其中，步驟(3)中弱堿性緩沖液是用磷酸氫二鈉調配的pH=9的溶液，步驟(4)中緩沖液是濃度為2.5mmol/L, pH=7.6的硫酸鉀緩沖液,步驟(4)中層析柱是5cmX73cm的Sephacryl S-200 層析柱。
[0017]本發明還提供了如下的技術方案:
[0018]一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，包括以下步驟:
[0019]a.將月桂酸、氯化亞砜和催化劑加入到反應器中，攪拌、加熱；
[0020]b.減壓分餾，獲得活化月桂酸；
[0021]c.將Cu/Zn-SOD溶于弱堿性緩沖液中溶解，加入活化月桂酸攪拌加熱，隨后將溶液濃縮然后迅速降溫至室溫；
[0022]d.加入無水乙醇，離心，收集沉淀，將沉淀溶解于雙蒸餾水，再次進行離心，除去不溶物，取上清液兌蒸餾水透析，收集酶活性部分，獲得月桂酸修飾的超氧化物歧化酶LA-SOD。
[0023]采用本方法修飾超氧化物歧化酶具有以下優點:酶回收率達到90%以上，無任何有害物質殘留，且常溫下穩定性高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1.天然SOD與LA-SOD紫外吸收光譜對比圖；
[0025]圖2.pH對天然SOD與LA-SOD酶的穩定性影響對比圖；
[0026]圖3.溫度對天然SOD與LA-SOD酶的穩定性影響對比圖；
[0027]圖4.人類胃液對天然SOD與LA-SOD酶的穩定性影響對比圖(37°C )。
【具體實施方式】
[0028]為更清楚的說明本發明的技術特點，下面通過【具體實施方式】對本發明進行詳細闡述。
[0029]實施例一
[0030]一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，步驟如下:[0031](1)將150ml月桂酸、9g氯化亞砜和8ml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至92°C，攪拌反應2小時，再回流2小時，
[0032](2)回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146~150°C的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末，置于冰箱中保存，
[0033](3)取200g濃度為4500U/mg的牛血Cu/Zn-SOD溶于18L弱堿性緩沖液(磷酸氫二鈉調配的pH=9的溶液)中，在20°C下攪拌溶解，邊攪拌邊加入50ml活化的月桂酸，然后升溫至40°C，攪拌60min后，將溶液濃縮至2500ml，然后迅速降溫至室溫，
[0034](4)加入3倍體積量的_18°C的無水乙醇，用轉速為4000r/min進行離心，收集沉淀，將沉淀溶解于2000ml的雙蒸懼水,再用4500r/min的轉速進行離心，除去不溶物,取上清液通過中空纖維透析器，兌蒸餾水透析，透析液預先用緩沖液(濃度為2.5mmol/L, pH=7.6的硫酸鉀緩沖液)平衡好的層析柱(5cmX73cm的Sephacryl S-200)層析2小時,最后收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶(LA-SOD)。
[0035]實施例二
[0036]一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，步驟如下:
[0037](1)將100ml月桂酸、5g氯化亞砜和5ml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至90°C，攪拌反應I小時，再回流I小時，
[0038](2)回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146~150°C的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末，置于冰箱中保存，
[0039](3)取150g濃度為4500U/mg的牛血Cu/Zn-SOD溶于15L弱堿性緩沖液(磷酸氫二鈉調配的pH=9的溶液)中，在20°C下攪拌溶解，邊攪拌邊加入40ml活化的月桂酸，然后升溫至40°C,攪拌60min后,將溶液濃縮至2000ml,然后迅速降溫至室溫，
[0040](4)加入3倍體積量的_18°C的無水乙醇，用轉速為4000r/min進行離心，收集沉淀，將沉淀溶解于1500ml的雙蒸懼水,再用4500r/min的轉速進行離心，除去不溶物,取上清液通過中空纖維透析器，兌蒸餾水透析，透析液預先用緩沖液(濃度為2.5mmol/L, pH=7.6的硫酸鉀緩沖液)平衡好的層析柱(5cmX73cm的Sephacryl S-200)層析1.5小時,最后收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶(LA-SOD)。
[0041]實施例三
[0042]一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，步驟如下:
[0043](1)將200ml月桂酸、15g氯化亞砜和IOml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至95°C，攪拌反應3小時，再回流3小時，
[0044](2)回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146~150°C的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末，置于冰箱中保存，
[0045](3)取250g濃度為4500U/mg的牛血Cu/Zn-SOD溶于20L弱堿性緩沖液(磷酸氫二鈉調配的pH=9的溶液)中，在20°C下攪拌溶解，邊攪拌邊加入60ml活化的月桂酸，然后升溫至40°C,攪拌60min后,將溶液濃縮至3000ml,然后迅速降溫至室溫，
[0046](4)加入3倍體積量的_18°C的無水乙醇，用轉速為4000r/min進行離心，收集沉淀，將沉淀溶解于2500ml的雙蒸懼水,再用4500r/min的轉速進行離心，除去不溶物,取上清液通過中空纖維透析器，兌蒸餾水透析，透析液預先用緩沖液(濃度為2.5mmol/L, pH=7.6的硫酸鉀緩沖液)平衡好的層析柱(5cmX73cm的Sephacryl S-200)層析2.5小時,最后收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶(LA-SOD)。
[0047]采用本方法所制備的LA-SOD性能分析結果如下:
[0048]1、酶回收率
[0049]用鄰苯三酚自氧化法測定LA-SOD的活力，結果顯示，采用本方法所制備的LA-SOD的活力為每毫克樣品含有S0D10650酶單位，酶回收率達到90%以上。
[0050]2、紫外吸收光譜
[0051]用日本島津UV-240分光光度計進行測定。
[0052]如圖1所示，LA-SOD的紫外吸收峰與天然SOD —致，仍在258nm處，所以說明采用本方法所制備的LA-SOD中無任何雜質殘留。
[0053]3、穩定性
[0054]3.1pH 穩定性
[0055]將LA-SOD和天然SOD分別放在不同pH值得緩沖液中，然后在25°C保溫2h，再測定SOD的活力并計算相對活力。
[0056]從圖2可知，用本方法所制備的LA-SOD的pH穩定性比天然SOD要高。
[0057]3.2熱穩定性
[0058]將LA-SOD和天然SOD分別置于不同的溫度下保溫2h，然后測定酶活力，并以25°C下的酶活力為基準來計算相對活力。
[0059]由圖3可知，兩種SOD的活力都隨溫度上升而下降，但是采用本方法所制備的LA-SOD對溫度的穩定性要高于天然S0D。
[0060]3.3在人胃液中的穩定性
[0061]取正常人空腹胃液10ml，分別稀釋成1:10，1:20，1:30，1:40，1:50，然后分別加入LA-SOD和天然SOD，37°C下保溫2h，再測定SOD活力并計算相對活力。
[0062]由圖4可知，采用本方法所制備的LA-SOD和天然SOD在胃液中活力均較低，但隨著胃液稀釋倍數增加，SOD活力上升。并且采用本方法所制備的LA-SOD比天然SOD穩定。
[0063]3.4室溫下存放的穩定性
[0064]采用本方法所制備的LA-SOD凍干粉置于室溫下存放一年，每隔一定時間測定其活力并計算相對活力。
[0065]結果顯示，采用本方法所制備的LA-SOD在室溫下存放一年，其活力變化不大，所以它在室溫下的有效保存期可達兩年以上。
[0066]綜上所述，采用本方法所制備的LA-SOD的穩定性很高。
【權利要求】
1.一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)將100~200ml月桂酸、5~15g氯化亞砜和5~1Oml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至90~95°C，攪拌反應I~3小時，再回流1~3小時， (2)回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146~150°C的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末，置于冰箱中保存， (3)取150~250g濃度為4500U/mg的牛血Cu/Zn_SOD溶于15-20L弱堿性緩沖液中，在20°C下攪拌溶解,邊攪拌邊加入40~60ml活化的月桂酸,然后升溫至40°C,攪拌60min后，將溶液濃縮至2000~3000ml，然后迅速降溫至室溫， (4)加入3倍體積量的-18°C的無水乙醇，用轉速為4000r/min進行離心，收集沉淀，將沉淀溶解于1500~2500ml的雙蒸餾水，再用4500r/min的轉速進行離心，除去不溶物，取上清液通過中空纖維透析器，兌蒸餾水透析，透析液預先用緩沖液平衡好的層析柱層析.1.5-2.5小時，最后收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶。
2.一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)將150ml月桂酸、9g氯化亞砜和8ml的催化劑吡啶DMF加入到反應器中，加熱至90~95°C，攪拌反應2小時，再回流2小時， (2)回流結束，讓反應物進行分餾，減壓，除去過量的氯化亞砜，收集146~150°C的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末，置于冰箱中保存， (3)取200g濃度為4500U/mg的牛血Cu/Zn_SOD溶于18L弱堿性緩沖液中，在20°C下攪拌溶解，邊攪拌邊加入50ml活化的月桂酸，然后升溫至40°C，攪拌60min后，將溶液濃縮至2500ml,然后迅速降溫至室溫， (4)加入3倍體積量的_18°C的無水乙醇，用轉速為4000r/min進行離心，收集沉淀，將沉淀溶解于2000ml的雙蒸餾水，再用4500r/min的轉速進行離心，除去不溶物，取上清液通過中空纖維透析器，兌蒸餾水透析，透析液預先用緩沖液平衡好的層析柱層析2小時，最后收集酶活性部分、透析、超濾、凍干，得到月桂酸修飾的超氧化物歧化酶。
3.如權利要求1或2所述的一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:步驟(3)中弱堿性緩沖液是用磷酸氫二鈉調配的pH=9的溶液。
4.如權利要求1或2所述的一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:步驟(4)中緩沖液是濃度為2.5mmol/L, pH=7.6的硫酸鉀緩沖液。
5.如權利要求1或2所述的一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:步驟(4)中層析柱是5cmX73cm的SephacrylS_200層析柱。
6.一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，包括以下步驟: a.將月桂酸、氯化亞砜和催化劑加入到反應器中，攪拌、加熱； b.減壓分餾，獲得活化月桂酸； c.將Cu/Zn-SOD溶于弱堿性緩沖液中溶解，加入活化月桂酸攪拌加熱，隨后將溶液濃縮然后迅速降溫至室溫； d.加入無水乙醇，離心，收集沉淀，將沉淀溶解于雙蒸餾水，再次進行離心，除去不溶物，取上清液兌蒸餾水透析，收集酶活性部分，獲得月桂酸修飾的超氧化物歧化酶LA-S0D。
7.根據權利要求6所述的一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，步驟a中加熱溫度為90°C~95°C，加熱時間為I~3小時，并且在回流的條件下進行，所述催化劑為吡啶DMF。
8.根據權利要求7所述的一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，步驟b中減壓分餾，收集146~150°C的餾分，即得到活化的月桂酸，然后再透析、凍干為白色粉末后冷藏。
9.根據權利要求8所述的一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，步驟d中加入的無水乙醇為濃縮液體積的3倍，無水乙醇溫度為_18°C。
10.根據權利要求8所述的一種月桂酸修飾超氧化物歧化酶的方法，其中所述透析液預先用緩沖液平衡好的層析柱層析1.5-2.5小時，所述緩沖液為濃度2.5mmol/L、pH為7.6的硫酸鉀溶 液。
【文檔編號】C12N9/96GK103805588SQ201410062990
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月24日 優先權日:2013年2月28日
【發明者】李華 申請人:無錫華奇生物科技有限公司