自組裝合成蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及合成蛋白支架的生成，該合成蛋白支架表現出有利于在使用合成蛋白 時向宿主免疫系統遞送和呈遞抗原的特異性功能和生物物理特性，即使所述抗原在宿主中 為免疫原性差的或為非免疫原性的，使得誘導宿主對抗原產生特異性抗體應答。描述一種 合成蛋白，該合成蛋白對哺乳動物免疫系統具有免疫原性，并且可組裝成穩定的限定多聚 體。另外，描述一種方法，該方法用于使用所述蛋白質以向免疫原性差或非免疫原性的肽賦 予免疫原性并且誘導對這些肽的特異性抗體應答。
[0002] 相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2013年3月15日提交的題為"Synthetic Self-Assembling Immunogenic Proteins"的美國專利申請序列號61/791，268的優先權，該專利以引用的方 式全文并入本文。
【背景技術】
[0004] 將外來（非自身）物質，即抗原，引入脊椎動物的免疫系統通常導致誘導宿主針對 該抗原的免疫應答。通常這將涉及B淋巴細胞和/或T淋巴細胞的刺激，以及識別并且結 合至該抗原的免疫球蛋白分子（抗體）的產生。存在大量影響物質在宿主中誘導免疫應答 的程度的因素。當免疫系統演進并且發展成對"自身"無應答時，外來性的程度是重要的。 大小也是一個顯著因素，較大分子大體上比較小分子更具免疫原性。低于約1000 Da分子量 的分子（分類為半抗原）太小，以致于無法以分離的形式被免疫系統發現，并且因此是非免 疫原性的，盡管這些分子仍具有抗原性。
[0005] 較大分子將更復雜，并且因此更可能含有多個免疫原性表位，并且還更易于被抗 原呈遞細胞（APC)吞噬和處理。物質的組成也是重要的，其中蛋白質無疑為最具免疫原性 的。多糖的免疫原性小得多（以分離的形式），并且核酸和脂質基本上無免疫原性。類似 地，顆粒抗原或變性抗原比可溶分子和天然分子更具免疫原性。外來物質的暴露途徑和生 物活性也可顯著影響宿主的任何免疫應答的性質和程度。例如，與免疫系統的組分或細胞 相互作用的物質的腸胃外注射將導致比相對惰性或非活性物質的粘膜暴露（攝取/吸入） 更強的應答。
[0006] T細胞和B細胞以不同的方式識別外來抗原并且對外來抗原作出應答。特化的抗 原呈遞細胞或APC (巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞）通過從細胞外空間吸收分子（包括大 分子和完整微生物）并且處理這些分子的蛋白內容物來連續地問詢它們的環境。外源蛋白 由核內體的一組蛋白酶消化，并且所得肽顯示在細胞表面上MHC II分子的溝槽中。這些肽 繼而由T細胞表面上的專門受體（TCR)識別。T細胞發展的過程確保顯示對含有自身肽的 MHC II作出反應的受體的那些T細胞耗盡，并且僅識別外來序列的那些T細胞成功地成熟。 T細胞識別的肽（T細胞表位）不變地是線性的，但是并不總是在肽來源的自然折疊蛋白質 上暴露或可觸及。
[0007] 相比之下，B細胞表面受體或免疫球蛋白（BCR)識別可溶蛋白（構象表位或變性 表位）、半抗原、多糖，和較小程度上的一些脂質和核酸，并且主要與這些相互作用。BCR的 特異性與B細胞可分泌的抗體的特異性相同。在結合其同源抗原之后，BCR內在化，并且結 合的抗原經處理。只有當抗原是蛋白質，或連接到蛋白質組分時，抗原才會作為MHC II復 合物的一部分被呈遞在細胞表面上。在這些條件下，B細胞然后可用于被具有識別呈遞肽 的TCR的T輔助細胞刺激。就大的蛋白或復雜蛋白而言，B細胞可因此被許多不同的T細 胞活化，這些T細胞不一定必須識別與BCR相同的抗原表位，但是所有T細胞將識別相同蛋 白質的肽組分。脊椎動物免疫系統能夠允許它們產生針對自身不具有免疫原性的抗原決定 子的抗體。
[0008] 為了開發有效疫苗，必須以這種方式將抗原表位呈遞到宿主免疫系統，以刺激強 免疫應答，涉及T淋巴細胞和B淋巴細胞兩者。不涉及效應子（輔助）T細胞的活化和B細 胞受這些效應子（輔助）T細胞的后續刺激的免疫應答通常持續時間短，并且不產生抗原記 憶，即當宿主第二次暴露于免疫原時，不引起更強力的且更快速的抗體應答。
[0009] 還常常需要引發能夠抑制、阻斷或以其他方式中和靶標的功能活性的抗體，并且 因此提供對宿主的保護的疫苗。出于許多原因，這會呈現一個大的挑戰。很多情況下，需要 被抗體應答靶向的那些表位未得到鑒別，因為缺乏與該靶標相關的結構功能數據。即使當 存在與靶標和靶標相互作用相關的詳細信息時，所鑒別的表位可能不是免疫顯性的，并且 因此可能不產生在大多數患者中發現的應答。在其他情況下，關鍵保護性抗原決定子可能 不是蛋白質，例如病原體糖蛋白上的多糖，并且因此以分離形式不具免疫原性（T細胞依賴 性）。
[0010] 絕大多數疫苗通過胃腸外途徑遞送；但是粘膜遞送存在許多優點，諸如患者的順 從性、自身施用、感染風險的減小、以及誘導粘膜免疫和系統性免疫兩者的可能性。還存在 許多要克服的障礙，諸如疫苗稀釋、微菌群的存在、當口服給予時承受低PH以跨膜的需要、 和對有效佐劑的需要（Vajdy等人，2004)。此外，粘膜施用可引起B細胞耐受性而非免疫應 答。劑量也可對免疫應答具有主要作用。如果免疫原未被免疫系統有效清除，或如果系統 被過高劑量侵沒，則可誘導耐受性。相反地，過低劑量也可引起耐受性，或簡單地無法刺激 足夠的免疫細胞。
[0011] 已發展多個方法以幫助克服這些困難。在大多數情況下，將疫苗與一些形式的佐 劑一起施用。佐劑基本上是當與免疫原一起施用時，引起以下情況中的一個或更多個的任 何制劑：注射位點處免疫原的持續、共刺激信號的增強、淋巴細胞增殖的非特異性刺激或肉 芽腫形成。佐劑具有多種形式，例如弗式完全佐劑由失活的分枝桿菌（Mycobacterium)組 成，而其他佐劑包含水包油（例如角鯊烯）乳液。這些最常用于動物中，因為它們可致使注 射位點處的不良反應。一些有機佐劑用于人類疫苗中，諸如Montamd# (基于植物組分 的礦物油），盡管更通常地，佐劑是無機佐劑，諸如鋁鹽。
[0012] 其中克服低免疫原性的最普及且廣泛采用的方法是將鑒別的或期望的抗原或抗 原決定子與強免疫原性載體偶聯。載體是來源于不同的物質的蛋白質或多肽，例如牛血清 白蛋白（BSA)和鑰孔蛾血藍蛋白（KLH)常常用作化學綴合的半抗原和小肽的載體以在動 物中產生抗體（Berzofsky和Berzofsky，1993)。載體在大到足夠被宿主免疫系統發現并且 處理的分子上呈遞半抗原，并且還通過具有固有免疫原性來刺激宿主免疫應答。
[0013] -般來講，來源于在種系發生方面更遠離接收者的來源的載體蛋白是較好的。然 后，載體可能更與宿主蛋白不同，并且因此更具外來性。選擇載體蛋白時的另一個重要的考 慮因素是以下可能性，即如果該載體蛋白是宿主蛋白的同系物，并且因此分享顯著的同源 性，則引發的免疫應答也可與宿主蛋白反應并且引起不良的副作用。非蛋白抗原僅可化學 偶聯，這可限制對抗原連接在載體上的位置和抗原呈遞方式的控制。小肽可化學上或基因 上偶聯。在研究的其他區域，生物信息學的現代發展已引起免疫原，并且尤其是肽的合理設 計的提尚。
[0014] 肽疫苗的構思是基于B細胞和T細胞表位的鑒定和化學合成，這些表位是免疫顯 性的并且可誘導特異性免疫應答，例如將靶分子的B細胞表位偶聯到廣泛識別的T細胞表 位以使該表位具有免疫原性（Naz R.K.和Dabir P.，2007)。當與較大和較復雜蛋白質抗原 比較時，可見肽相對易于產生。肽還可具有有利的化學穩定性，并且不含致癌或感染可能， 這使它們成為有吸引力的疫苗候選物。但是，若干障礙限制肽疫苗的普遍可用性，包括通常 它們的固有免疫原性低并且需要較好的佐劑和載體。其他研究提出，重組嵌合蛋白可制成 為更具免疫原性，若T輔助表位以串聯重復序列的形式摻入（Kjerrulf M等人，1997)。
[0015] 另一類普及的載體蛋白是細菌類毒素。就針對細菌感染的疫苗而言，在感染的癥 狀由毒素的作用造成的情況下，那么這些毒素可用作疫苗本身。當然必須化學上地或通過 使用無毒的組分來使毒素無效。在20世紀發展的此類衰減的毒素例如白喉和破傷風疫苗 稱為類毒素。諸如Wyeth(Pfizer)、Aventis Pasteur、GSK、Merck等公司的在使用或后期 發展中的多糖-蛋白質綴合物疫苗使用破傷風、白喉或其他類毒素。
[0016] 許多人已提出霍亂毒素或大腸桿菌（E. coli)熱不穩定腸毒素（LT)的B亞基作 為各種疫苗應用的可用的載體蛋白（Nemchinov，L.G等人，2000 ;George-Chandy，A.等人 2001 ;美國專利6, 153, 203)。它具有高免疫原性，并且在不存在CT-A亞基的情況下是無毒 的。形成廣泛使用的霍亂疫苗的基礎，當全身性使用時，它被證實具有安全性。盡管相對小 (約12kDa)，但是它可組裝成穩定的五聚體中，這為它提供較高的分子量。
[0017] 許多研究人員尤其感興趣的是利用CTB和腸毒素五聚體對Gmi神經節苷脂的親和 力，Gmi神經節苷脂是有核細胞的表面上發現的一種支鏈五糖。在霍亂感染期間，這種結合 促進全毒素跨腸上皮易位。在文獻中存在大量報道，基于CTB融合（化學或遺傳的）的疫 苗在口服或鼻腔內施用時可對刺激粘膜免疫有效（George-Chandy，A.等人，2001 ;Houhui Song 等人，2003 ;Shenghua Li 等人，2009 ;Harakuni，Α·等人，2005)。為了保持與 經 節苷脂（其在相鄰CTB亞基之間形成的口袋處結合）反應的能力，必須的是，靶抗原不阻斷 Gmi結合位點的進入并且不阻止CTB多聚體的組裝。
[0018] 已證實，可對CTB進行遺傳融合，此類遺傳融合成功地保持Gmi結合，但是也存在限 制。Liljeqvist，S.等人（1997)示出，鏈狀球菌蛋白G的血清白蛋白結合結構域可基因融 合到CTB的N末端或C末端，或同時融合到兩個末端，并且保持Gmi結合。然而應指出，N末 端融合蛋白和雙融合蛋白在形成穩定的五聚體方面效率顯著較低，并且在結合至Gmi方面 不夠有效。類似地，已證實，除非存在嵌合和野生型CTB兩者的異種混合物，否則大的遺傳 融合蛋白不能形成五聚體（Harakuni，A.等人，2005)。
【發明內容】
[0019] 根據本公開，由于合成載體的固有免疫刺激和類似佐劑的特性，合成載體的高免 疫原性性質能夠提高宿主對所包括的可變序列的免疫應答。還公開根據本公開的合成載體 將使得宿主產生對至少部分地由可變序列編碼的"自"抗原決定子的抗體應答。
[0020] 在一個例示性實施例中，重組合成蛋白能夠組裝成穩定的均五聚體，其中每個單 體包括一個或更多個來源于靶蛋白的抗原決定子。
[0021] 在另一個例示性實施例中，重組合成蛋白能夠組裝成穩定的雜五聚體，其中表達 不同的抗原決定子的單體組裝在一起。
[0022] 在另一個例示性實施例中，重組合成蛋白基本上類似于以下序列：FTDIITDICGEYH NTQIHTLNDKILSYTESLVGKREIILVNFKGGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLSNSKIEKLCVWNN KTPHSIAAISMVR(序列 ID :1)
[0023] 在另一個例示性實施例中，重組合成蛋白包括接頭或間隔區序列，由此定位在合 成載體的一個或兩個末端處的可變序列以這樣的方式與合成載體分開，其方式為使得若干 重組蛋白的合成載體元件締合。在一個例示性實施例中，具有連接到生長因子的接頭序列 的重組合成蛋白基本上類似于以下序列：
[0024] ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW