一種七肽emlqppl及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種合成多肽及其應用。
【背景技術】
[0002] 生物活性肽是對機體的功能或狀態具有積極作用并最終影響機體健康的特殊蛋 白質片段。相較于蛋白質而言，小分子肽片段的優越性主要體現在：更易被人體吸收利用； 活性高，在較小濃度下即可發揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過 人工化學合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在 吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優越性。已有研究證實，人體小腸存在專 門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質經過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸 收。許多研究表明，各種來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種 作用，成為生物醫藥和保健品開發的熱點。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種具有體外抗腫瘤活性的合成多肽即合成七肽，可應用于 生物制藥領域。
[0004] 本發明選取兩種腫瘤細胞MCF-7和Η印G-2為研究對象，使用MTT法測定合成肽的 體外抑制活性。
[0005] 本發明所述的合成多肽縮寫為EMLQPPL，分子量827. 5,序列為： Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu。其中， Glu表示英文名稱為Glutamicacid，中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應殘基； Met表示英文名稱為Methionine，中文名稱為甲硫氨酸的氨基酸的相應殘基； Leu表示英文名稱為Leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應殘基； Gin表示英文名稱為Glutamine，中文名稱為谷氨酰胺的氨基酸的相應殘基； Pro表示英文名稱為Proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應殘基； Leu表示英文名稱為Leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應殘基。
[0006] 本發明所述的氨基酸序列采用標準Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合 成方法。將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這 個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復這一過程，即 可以得到目標多肽產物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產 物。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。
[0007] 本發明將終濃度為100-500Pg/mL的合成多肽與兩種腫瘤細胞MCF-7和Η印G-2 混勻，孵育48h后，經ΜΤΤ法檢測，對腫瘤細胞抑制率達到7. 46%~39. 95%，對肝癌細胞 Η印G-2和乳腺癌細胞MCF-7的體外增殖抑制率分別為14. 10%-39. 95%和7. 46%-34. 39%。所 述七肽EMLQPPL在濃度為50(^g/mL時，對肝癌細胞Η印G-2和乳腺癌細胞MCF-7的體外增 殖抑制率分別為39. 95%和34. 39%，可在生物醫藥領域中應用。
[0008] 與現有技術相比，本發明具有如下優點和技術效果： 本發明首次合成了該肽，并且采用MTT方法檢測了合成多肽的體外抗腫瘤活性，所述 合成多肽具有一定的腫瘤細胞抑制能力。
【附圖說明】
[0009]圖 1 為合成多肽Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的HPLC圖。
[0010] 圖 2 為合成多肽Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的ESI-MS圖。
【具體實施方式】
[0011] 以下結合具體實例對本發明作進一步說明，但本發明的實施和保護范圍不限于 此。對于未特別注明的工藝參數，可參照常規技術進行。
[0012] 多肽固相合成 選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的特征，先將Leu的羧基以共價鍵的形式與一個樹脂相 連，然后Leu的氨基和Pro的羧基縮水反應，處理后，再添加Pro,Pro的氨基和Pro的 羧基反應，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個Glu氨基酸后，再切除樹脂即得到目 標多肽。采用高效液相色譜進行純化，色譜柱型號為PhenomenexC1S，尺寸4. 6*150mm， 流動相A:含有0. 1%三氟乙酸（TFA)的水；流動相B:含有0. 09%TFA的溶液（80%乙 腈+20%水）；20min內B相由14. 0%上升到24. 0%，流速1. 0mL/min，檢測波長220nm。 液氮速凍，冷凍干燥，得到最后的產品，要求純度達到98. 2%以上，并經ESI-MS鑒定結 構。圖1為合成多肽Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的HPLC圖。圖2為合成多肽 Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu的ESI-MS圖。
[0013] 合成多肽的體外抗腫瘤活性 通過MTT比色法分析各多肽組分對肝癌細胞Η印G-2和乳腺癌細胞MCF-7的生長抑制 作用。具體操作步驟如下： 1) 取對數生長期的細胞，經0. 25%(體積)的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相應的 完全培養基終止消化并重懸細胞，血球平板計數后，調整細胞懸液的濃度至5X104個/mL， 加至96孔板中，每孔100μL，于37 °C恒溫C02培養箱中培養； 2) 培養24h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為200μL的含有不同濃度待測 樣品的新鮮基礎培養基，并以PBS為陰性對照，于37 °C恒溫C02培養箱中培養； 3) 48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎培 養基180μL;于37 °C恒溫C02培養箱中繼續培養； 4) 4h后，棄去含有MTT的培養液，加入150μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min， 490nm波長處測定光密度值并計算抑制率： 癌細胞生長抑制率（%)=((對照組0D-空白組0D)-(給藥組0D-空白組0D))八（對照 組0D-空白組0D) )X100 應用實施例1 腫瘤細胞MCF-7和Η印G-2各100μL細胞懸液（5X104個/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養箱中培養，24h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為200μL的100 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎培養基，并以PBS為陰性對照，于37 °C恒溫C02培養箱中培 養.。48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎培養 基180μL;于37 °C恒溫C02培養箱中繼續培養；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養液，加入150 μLDMSO后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長處測定光密度值并計算抑制率，由表 1可知，100Kg/mL的多肽對腫瘤細胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別14. 10%和7. 46%。
[0014]表 1
應用實施例2 腫瘤細胞MCF-7和Η印G-2各100μL細胞懸液（5Χ104個/mL)，加至96孔板中，于 37 °C恒溫C02培養箱中培養。24h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為200μL 的200Pg/mL的多肽樣品的新鮮基礎培養基，并以PBS為陰性對照，于37 °C恒溫C02培養 箱中培養。48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基 礎培養基180μL;于37 °C恒溫C02培養箱中繼續培養；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養液， 加入150μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長處測定光密度值并計算抑 制率，由表1可知，200Pg/mL的多肽對腫瘤細胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別19. 77%和 19. 25%〇
[0015] 應用實施例3 腫瘤細胞MCF-7和Η印G-2各100μL細胞懸液（5X104個/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養箱中培養.24h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為200μL的300 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎培養基，并以PBS為陰性對照，于37 °C恒溫C02培養箱中培 養.48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎培養 基180μL;于37 °C恒溫C02培養箱中繼續培養；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養液，加入150 μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長處測定光密度值并計算抑制率，由表 1可知，300Pg/mL的多肽對腫瘤細胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別26. 48%和29. 92%。
[0016] 應用實施例4 腫瘤細胞MCF-7和Η印G-2各100μL細胞懸液（5X104個/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養箱中培養.24h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為200μL的400 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎培養基，并以PBS為陰性對照，于37 °C恒溫C02培養箱中培 養.48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎培養 基180μL;于37 °C恒溫C02培養箱中繼續培養；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養液，加入150 μLDMS0后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長處測定光密度值并計算抑制率，由表 1可知，400Pg/mL的多肽對腫瘤細胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別30. 14%和32. 01%。
[0017] 應用實施例5 腫瘤細胞MCF-7和Η印G-2各100μL細胞懸液（5X104個/mL)，加至96孔板中，于37 °C恒溫C02培養箱中培養.24h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為200μL的500 Kg/mL的多肽樣品的新鮮基礎培養基，并以PBS為陰性對照，于37 °C恒溫C02培養箱中培 養.48h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和新鮮基礎培養 基180μL;于37 °C恒溫C02培養箱中繼續培養；4h后，棄去含有ΜΤΤ的培養液，加入150 μLDMSO后于微型振蕩器上振蕩15min，490nm波長處測定光密度值并計算抑制率，由表 1可知，500Pg/mL的多肽對腫瘤細胞Η印G-2和MCF-7的抑制率分別39. 95%和34. 39%。
【主權項】
1. 一種七肽EMLQPPL，其特征是該合成七肽EMLQPPL的氨基酸序列為Glu-Met-Leu-Gln-P r〇-Pr〇-Leu〇2. 權利要求1所述一種七肽EMLQPPL的應用，其特征在于將終濃度為100-500噸/ mL的合成多肽與兩種腫瘤細胞MCF-7和H印G-2混勻，孵育48 h后，對肝癌細胞H印G-2和 乳腺癌細胞MCF-7的體外增殖抑制率分別為14. 10%-39. 95%和7. 46%-34. 39% ;所述七肽 EMLQPPL 的濃度為 100-500 Pg/mL。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述七肽EMLQPPL在濃度為500Pg/mL時， 對肝癌細胞H印G-2和乳腺癌細胞MCF-7的體外增殖抑制率分別為39. 95%和34. 39%。4. 權利要求1所述的七肽EMLQPPL在制備生物醫藥中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種七肽EMLQPPL及其應用，所述合成多肽的氨基酸序列如下所示：Glu-Met-Leu-Gln-Pro-Pro-Leu，縮寫為EMLQPPL，分子量827.5，純度98.2%。本發明的多肽使用多肽合成儀，采用固相合成法合成。通過體外抗腫瘤活性檢測，在100-500μg/mL范圍內，本發明的多肽對肝癌細胞HepG-2和乳腺癌細胞MCF-7均呈現出了一定的抑制效果。在500μg/mL時，對HepG-2和MCF-7的體外增殖抑制率分別為39.95%和34.39%。本發明提供一種具有體外抗腫瘤活性的合成多肽，可應用于生物制藥領域。
【IPC分類】C07K7/06, A61K38/08, A61P35/00
【公開號】CN105237624
【申請號】CN201510634091
【發明人】張學武, 何勝潔
【申請人】華南理工大學
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月28日