水稻類病斑突變基因lil1及應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體設及一種水稻類病斑突變基因，同時設及該基因 在稻攝病菌抗性中的應用。
【背景技術】
[0002] 稻攝病是世界性的重要水稻病害，在水稻的整個生育期均可造成危害，一般情況 減產10% -20%，重的達40-50%，甚至顆粒無收。近年來，稻攝病年發生面積呈現逐年增加 趨勢，局部大爆發也不少見。栽培抗病品種是生產上防治稻攝病最經濟有效的途徑，因此發 掘新的稻攝病抗性基因對水稻的抗病育種意義重大。
[0003] 過敏性壞死反應化ypersensitiveresponse,HR)是植物對抗病原物侵染的一種 自我保護機制。過敏性壞死反應發生時，受感染部位及其周圍的寄主細胞能快速發生細胞 程序化死亡（ProgrammedCellDeath,PCD)，形成壞死斑，限制病原物進一步擴展，從而達 到抗病的作用。植物類病斑突變體（lesionmimicmutant,LMM)是一類在沒有明顯逆境、 損傷或病原物侵染的條件下，能在植株上自發形成壞死斑的突變體，運些突變體的表型與 HR相似，表現出明顯的細胞程序化死亡現象。很多類病斑突變材料在壞死斑形成之前或之 后可表現局部或系統的抗性。如水稻spill突變體表現出稻攝病菌（真菌）和水稻白葉枯 病菌（細菌）的雙重抗性；水稻spll突變體激活抗病基因PBZ1的表達，對稻攝病菌的不同 生理小種均有抗性。因此，盡可能多的發現和克隆水稻類病斑突變基因是尋找稻攝病抗性 基因的有效途徑。
[0004] 近年來應用分子遺傳學的手段，已經發現和克隆了部分水稻中類病斑突變體的突 變基因，其中一些的確與稻攝病的抗性相關。比如水稻Spill和水稻Spll8基因都能增強 植株對稻攝病的抗性，水稻Sekiguchi類病斑突變體在光照條件下能提高植株對稻攝病菌 的抗性。
【發明內容】
陽〇化]本發明的目的在于提供一種新的水稻類病斑突變基因，該突變基因激活了水稻抗 病相關基因的表達，并對稻攝病菌的抗性顯著增強。
[0006] 本發明人從釉稻品種93-11EMS誘變群體中發現一個類病斑突變體，命名為 LIL1 (Li曲t-induced-lesionmimicmutant1)。該突變體類病斑的形成和發展是一個類 似過敏反應的細胞程序化死亡過程。抗病相關基因PR1、PR-lOa、P0C-1和P0X22. 3基因 在LIL1體內的表達量相對野生型93-11明顯增加，且突變體對稻攝病菌的抗性顯著增強。 通過圖位克隆的方法，將LIL1基因精細定位于水稻7號染色體222. 3化的范圍內，目前定 位或克隆的水稻類病斑突變基因無一位于定位區域，因此運是一個新的水稻類病斑突變基 因。對定位區域內的基因進行了測序，發現一個編碼Tyr受體類激酶的基因，在突變體LIL1 中存在一個核巧酸的變異，導致該基因編碼蛋白質的第429號氨基酸由鄉氨酸變成了異亮 氨酸，其氨基酸序列如SEQID齡.2所示。采用^斗〇?技術克隆1比1基因的〔05編碼區 序列（如SEQIDNo. 3所示），并構建了超表達載體，通過轉基因驗證，確定該突變的Tyr受 體類激酶的基因為LIL1基因，其序列如SEQIDNo. 1所示。
[0007] 本發明LIL1基因的表達可顯著增強了水稻對稻攝病菌的抗性，該基因的發現和 克隆為水稻抗稻攝病的抗性育種提供了新的基因資源。
【附圖說明】
[0008] 圖1是突變體LIL1的表型圖。
[0009] 其中，A:大田條件下突變體LIL1的表型，1 :突變體LIL1植株，2 :野生型93-11 ; B:突變體LIL1老葉與新葉對比，1 :老葉，2 :新葉；C:無菌條件下突變體LIL1的表型；D:突 變體LIL1遮光處理的表型。
[0010] 圖2是LIL1基因對稻攝病的抗性影響圖。
[0011] 圖3是LIL1基因精細定位圖。
[0012] 圖4是候選基因在突變體LIL1和野生型93-11內的表達情況。
[0013] 圖5是LIL1基因的突變位點測序峰圖。
[0014] 其中，A:LIL1;B:野生型 93-11。
[0015] 圖6是LIL1蛋白突變位置。
[0016] 圖7是LIL1基因全長cDNA的RT-PCR結果電泳圖。
[0017] 其中，Μ:marker500bpDNAladder;1 :LIL1 基因。
[0018] 圖8是LILl基因超表達載體的構建結果電泳圖。
[0019] 其中，Μ:marker化bDNAladder;1、2 :LIL1基因超表達載體；3、4 :超表達載體的 酶切結果。
[0020] 圖9是轉基因植株潮霉素檢測結果圖。
[0021] 其中，Μ:markerDL2000 ;1-24 :轉LIL1 基因植株；1、3、6、8、10、14、17、19、20、21、 23、24為陽性。
[0022] 圖10是LIL1抗性相關基因的表達圖。 陽02引其中，A、C:3葉期；B、D:灌漿期。
[0024] 圖11是轉LIL1基因水稚對稚攝病的抗性增強圖。
【具體實施方式】
[0025] 實施例1突變體LIL1的表型鑒定 陽0%] 結合參見圖1，將突變體LIL1植株與野生型93-11進行比較，可知，突變體LIL1植 株較野生型明顯矮化（圖1A)，類病斑3葉期始現，類似過敏反應壞死斑。老葉上的斑點較 新葉多且密（圖1B)，無菌環境下同樣表現出類病斑（圖1C)。光照對類病斑的形成有影響， 錫錐紙遮光處理的部位類病斑明顯較未遮光處少（圖1D)。
[0027] 突變體LIL1對供試稻攝病菌有明顯抗性（圖2)。
[0028] 實施例2LIL1突變基因的定位與候選
[0029] 利用圖位克隆的方法將LIL1基因精細定位于水稻7號染色體222. 3化的范圍內 (圖3)，通過基因表達差異分析（圖4)和測序，發現一個編碼Tyr受體類激酶的基因在突 變體LIL1中存在一個核巧酸的變異（圖5)，導致該基因編碼蛋白質的第429號氨基酸由鄉 氨酸變成了異亮氨酸，且突變的位點剛好位于激酶的催化結構域中（圖6)。多個品種栽培 稻和野生稻運一位點的測序結果說明該位點在自然進化的過程當中相當保守。據此推測該 突變為EMS誘變產生。
[0030] 實施例3LIL1突變基因的CDS克隆及測序 陽03U 根據LIL1基因序列設計引物，引物序列如下：
[0032] LIL1-F，CAGGTACC|ATGGCCATTTTGACCGTTCTGCC(如沈QIDNo. 4 所示）
[0033] LIL1-R，CTGGATCC|TTACCTGCCGTTCACAATTGTTATGG(如沈QIDNo. 5 所示）。
[0034] 為了方便克隆入表達載體，引物序列前加入了相應酶切位點（下劃線）的序列， RT-PCR克隆LIL1基因的CDS編碼區（圖7)。
[0035] 具體操作過程如下：
[0036] (1)植物RNA的提取
[0037] 取突變體LIL1 3葉期全株為材料提取RNA，步驟如下：
[0038] 1)收集100-200mg組織，用液氮將組織材料充分研磨成粉末；
[0039] 2)待液氮揮發后，將粉末迅速轉移至化ase化ee離屯、管，立即加入1ml的Trizol 提取液，蓋緊管蓋，滿旋震蕩30s，使樣品充分混勻，室溫放置5min; W40] 如加入0. 2ml氯仿劇烈振蕩混勻1