一種室內水稻品種稻瘟病抗性鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業技術領域，具體地說，涉及一種室內水稻品種稻瘟病抗性鑒定方法。
【背景技術】
[0002]水稻是全球尤其是亞洲地區重要的糧食作物，而由子囊菌引起的稻瘟病(Magnaporthe oryzae)是影響水稻安全生產的主要病害之一，加上稻痕病在實際防治上的復雜性、分布的廣泛性以及危害的嚴重性，因此稻瘟病一直受到各地政府和研究者的高度關注。
[0003]湖北省地處長江中下游，地貌復雜，省內既有高山又有丘陵、平湖。水稻一直是湖北省種植面積最大、總產最多的農作物，播種面積占全省糧食總播種面積的50%以上，總產占70%左右，商品量占80%，而且湖北水稻在種植面積、總產、單產、優質稻種植面積等方面多年來一直穩居全國各省市水稻生產的前列。稻瘟病在全省各稻區均可發生，發生面積達300?600萬畝，占整個水田面積的11%?22%，病害流行的年份造成當地顆粒無收。病情的普遍性和嚴重性影響著湖北省水稻生產的產量和質量，嚴重制約了水稻育種產業化進程，嚴竣的病害現實和慘痛的歷史教訓，讓人們在考察一份水稻材料是否適宜推廣應用時不得不把是否抗稻瘟病作為其必備的前置優良品質。利用抗病品種抵抗稻瘟病的流行是行之有效的安全措施，而在實際生產中，單一的抗病品種在長時間大面積種植后抗性表現為喪失，造成稻瘟病的流行和暴發，因此不斷地尋找新的抗源材料是水稻育種和抗病研究者長期的科研任務。
[0004]抗病品種在大田生產中表現為抗性，其中一個基礎前提是鑒定的結果穩定可靠。利用大田自然誘發技術鑒定水稻品種(材料)的抗瘟性是目前一個穩定可靠的鑒定技術，但是大田自然誘發的鑒定結果需歷時數月且對當年的天氣情況有要求，因此在追求效率的當下，在室內對水稻品種(材料)采用一套操作簡單、結果穩定的技術，鑒定其對稻瘟病的抗性、繼而將抗病品種(材料)作為抗源材料用于科學研究或生產實踐尤其顯得重要。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種室內水稻品種稻瘟病抗性鑒定方法，其試驗結果可以為大田推廣品種、品種(材料)抗性基因的挖掘等奠定穩定可靠的基礎。其具體技術方案為:
[0006]—種室內水稻品種稻瘟病抗性鑒定方法，包括以下步驟:
[0007]I)采用孢子振落法分離稻瘟病菌單孢:先將穗頸瘟標本置于無菌水中浸泡48h，后移至培養皿中保濕培養48h使之產孢，培養皿中預先放有浸有無菌水的吸水紙，吸水紙一端作成紙枕，使標本兩端接觸吸水紙、病斑部分懸空，溫度26°C，光:暗=12h:12h ;當病斑部分出現一層灰綠色細密孢子，用洗耳球將孢子輕輕吹落于事先準備好的清水瓊脂培養基上，進行鏡檢，把視野中的單個孢子打好標記，挑取標記部位的瓊脂置于PDA上使之萌發生長；將分離出的單孢菌株轉入保存培養基中，并置于4°C冰箱中保存備用；
[0008]2)采用涂菌產孢法制備孢子懸浮液:將保存的各單孢菌株活化于PDA斜面上，從邊緣挑取Icm大小的菌絲塊轉接于OTA平板上，待菌蓋擴展至培養皿面積70%左右時，用無菌水洗下培養皿上的菌絲，洗下的菌液涂布于另一番茄燕麥培養基平板上，48h后用無菌水打斷皿中長出的氣生菌絲，自然晾干后以潔凈的紗布覆蓋，置于光照培養箱中紫光燈48h促其產孢；用無菌水洗下孢子，過濾、攪勻，加入0.025% Tween-20通過血板計數器將孢子懸浮液的孢子濃度調整為5 X 15個孢子/ml ;
[0009]3)待秧苗長至三葉一心時，將孢子懸浮液用小型噴霧器均勻噴灑于鑒定品種的葉片上，至葉片上沾有細密菌液而不滴落為止，每處理3次重復；接種完畢后，在育秧盤上蓋上塑料薄膜，于26°C黑暗保濕培養36h，去掉薄膜后光照培養6?7d，期間輔以人工噴霧，保持塑料盤中不斷水；每天觀察病情待病情穩定后調查；按如下標準記錄病情:R抗病:葉片上無病斑或產生針頭狀褐點或大褐點；S感病::葉片上產生橢圓形或梭形大病斑，中間灰白色，邊緣黃褐色；
[0010]4)待秧苗長至三葉一心時，剪下心葉留取其中間葉段平鋪于培養皿中，皿中預先放有浸有無菌水的濾紙，每皿平鋪3個葉段，接種前打開培養皿蓋用彌霧噴霧器向皿中的葉段上噴灑一層細密的0.025% Tween-20液體，用移液槍移取菌液點滴于每個葉段之上，每個葉段滴3滴，每滴5 μ I ;蓋好培養皿于26°C黑暗保濕培養36h，后光照培養6?7d ;每天觀察病情待病情穩定后調查；按如下標準記錄病情:若接種點中央灰白，有孢子產生，邊緣有褪綠，且沿葉脈擴展，記為感病S ;接種點無癥狀或呈黑色，無褪綠且未沿葉脈擴展，記為抗病R ;最終反應型以至少出現一處感病病斑為親和記為I，無病斑或有過敏性壞死癥狀記為不親和記為O ;每次接種結果成功與否均以麗江新團黑谷表現感病為可靠性指標，試驗重復3次；
[0011 ] 5)秧苗7-8葉期時，在心葉附近的莖桿部位注射接種孢子懸浮液，接種量100 μ I，7-10d后調查；試驗重復3次；病級調查參照標準:1級:沒有病斑；2級:病斑黑褐色，只有針尖大小，不產分生孢子；3級:病斑長度0.5-1.0mm,黑褐色，不產分生孢子；4級:病斑較小，長度略大于2.0mm,中心灰色、邊緣黃褐色，產孢；5級:病斑較大，長度2.0mm以上，產孢；6級:產孢，大型病斑相互連接。
[0012]進一步，病級統計分析時，I?3級歸為抗病反應類型，記為R ;4?6級歸為感病反應類型，記為S。
[0013]進一步，所述PDA為葡萄糖20g，土豆200g，瓊脂粉18g，水1000ml。
[0014]進一步，所述OTA為番茄汁150ml，燕麥200g，瓊脂粉18g，水1000ml。
[0015]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0016]本發明該方法先后利用噴霧接種、點液接種、注射接種這3種稻瘟病人工接種方法，構建了一套室內用于鑒定水稻品種(材料)對稻瘟病抗性情況的成熟技術，應用范圍可包括稻瘟病菌生理小種測定、品種抗性鑒定及基因推導、分離群體抗性鑒定等，該方法省工省時且結果穩定，此套技術的鑒定結果必會為有關水稻稻瘟病抗性基因的研究與生產奠定可信的基礎。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0018]單孢的分離及孢子懸浮液的制備及接種方法
[0019]噴霧接種、點液接種、注射接種是目前應用最多的三種稻瘟病接種方法，本研究小組通過多年的試驗，揉合上述三套方法用于稻瘟病室內抗性鑒定。
[0020]采用孢子振落法分離稻瘟病菌單孢:先將穗頸瘟標本置于無菌水中浸泡48h，后移至培養皿中保濕培養48h使之產孢，培養皿中預先放有浸有無菌水的吸水紙，吸水紙一端作成紙枕，使標本兩端接觸吸水紙、病斑部分懸空(溫度26°C，光:暗=12h:12h)。當病斑部分出現一層灰綠色細密孢子，用洗耳球將孢子輕輕吹落于事先準備好的清水瓊脂培養基上，進行鏡檢，把視野中的單個孢子打好標記，挑取標記部位的瓊脂置于PDA上使之萌發生長。將分離出的單孢菌株轉入保存培養基中，并置于4°C冰箱中保存備用。
[0021]采用涂菌產孢法制備孢子懸浮液:將保存的各單孢菌株活化于PDA(葡萄糖20g，土豆200g，瓊脂粉18g，水1000ml)斜面上，從邊緣挑取Icm大小的菌絲塊轉接于OTA (番茄汁150ml，燕麥200g，瓊脂粉18g，水1000ml)平板上，待菌蓋擴展至培養皿面積70%左右時，用無菌水洗下培養皿上的菌絲，洗下的菌液涂布于另一番茄燕麥培養基平板上，48h后用無菌水打斷皿中長出的氣生菌絲，自然晾干后以潔凈的紗布覆蓋，置于光照培養箱中紫光燈48h促其產孢。用無菌水洗下孢子，過濾、攪勻，加入0.025% Tween-20通過血板計數器將孢子懸浮液的孢子濃度調整為5X 15個孢子/ml。
[0022]噴霧接種方法
[0023]屬于活體接種:待秧苗長至三葉一心時，將孢子懸浮液用小型噴霧器均勻噴灑于鑒定品種的葉片上，至葉片上沾有細密菌液而不滴落為止，每處理3次重復。接種完畢后，在育秧盤上蓋上塑料薄膜，于26°C黑暗保濕培養36h，去掉薄膜后光照培養6?7d，期間輔以人工噴霧，保持塑料盤中不斷水。每天觀察病情待病情穩定后調查。按如下標準記錄病情:R(抗病):葉片上無病斑或產生針頭狀褐點或大褐點。S(感病)::葉片上產生橢圓形或梭形大病斑，中間灰白色，邊緣黃褐色。
[0024]點液接種方法
[0025]屬于離體接種:待秧苗長至三葉一心時，剪下心葉留