呼吸道病原體的雙重熒光pcr檢測引物、探針、反應液及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種能快速檢測呼吸道16項病原體的雙重熒光PCR(聚合酶鏈式反應） 檢測引物、探針、反應液及試劑盒，屬于核酸檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 發熱呼吸道癥候群(FRS)是現階段我國最主要的一組傳染病之一，通過十一五和 十二五'艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治'科技重大專項實施，我國建立了覆蓋全國 的跨部門、跨學科傳染病防控支撐技術平臺，實現了傳染病應急處置能力由點到面的提升。 我國發熱呼吸道癥候群監測方案(2012版)要求發熱呼吸道癥候群監測實驗室對所采集的 標本中的鼻/咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物、支氣管肺泡灌洗液及胸腔穿刺液標本，進行流感病 毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒Π型、副流感病毒m型、人偏肺病 毒、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒NL63、冠狀病毒229E、冠狀病毒0C43、人博卡病毒、鼻病毒、腸道 病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的核酸檢測。
[0003]呼吸道疾病可由幾十種病原體引起，病原體的最終確認需要大量的操作步驟，費 時費力。
【發明內容】
[0004]本發明的主要目的是提供一種能同時能快速檢測呼吸道16項病原體的雙重熒光 PCR檢測試劑盒。
[0005]為實現上述目的，本發明提出如下技術方案：
[0006] -種用于呼吸道病原體的雙重熒光PCR檢測的PCR引物，所述PCR引物擴增下述16 種呼吸道病原體中的至少一種的基因突變位點：呼吸道合胞病毒、腸道病毒、冠狀病毒 NL63、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒229E和冠狀病毒0C43、副流感病毒1型和2型、鼻病毒和副流 感病毒3型、人博卡病毒和人偏肺病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體、腺病毒和嗜肺軍團菌;所 述PCR引物為以下16對中的至少一對：SEQIDN0.1和SEQIDN0.2;SEQIDN0.4和SEQID N0·5;SEQIDN0·7和SEQIDN0·8;SEQIDN0·10和SEQIDN0·11;SEQIDN0·13和SEQID N0·14;SEQIDN0·16和SEQIDN0·17;SEQIDN0·19和SEQIDN0·20;SEQIDN0·22和SEQ IDNO.23;SEQIDNO.25和SEQIDNO.26;SEQIDNO.28和SEQIDNO.29;SEQIDNO.31和 SEQIDNO.32;SEQIDNO.34和SEQIDNO.35;SEQIDNO.37和SEQIDNO.38;SEQID NO.340和SEQIDNO.41;SEQIDNO.43和SEQIDNO.44;SEQIDNO.46和SEQIDNO.47。
[0007]本發明還提出一種用于檢測呼吸道病原體基因片段的TaqMan探針，所述探針用于 檢測上述呼吸道病原體中的至少一種;所述探針包括下述基因序列中的至少一個：SEQID N0.3、SEQIDN0.6、SEQIDN0.9、SEQIDN0.12、SEQIDN0.15、SEQIDN0.18、SEQID N0.21、SEQIDN0.24、SEQIDN0.27、SEQIDN0.30、SEQIDN0.33、SEQIDN0.36、SEQID N0.39、SEQIDN0.42、SEQIDN0.45、SEQIDN0.48。
[0008]本發明還提出一種用于檢測呼吸道病原體的PCR反應液，用于檢測上述病原體中 的至少一種;上述的PCR引物和TaqMan探針。
[0009]本發明還提出一種用于檢測呼吸道病原體的雙重熒光PCR檢測試劑盒，其特征是： 包括:預分裝的如權利要求3所述的PCR反應液，RT-PCR酶，陽性質控品和陰性質控品。
[0010] 本發明開發的檢測試劑可在2小時內完成16項呼吸道癥候群病原體篩查，大幅度 節約檢測時間和成本。
[0011] 本發明的優點是操作簡單，實用性強，非常容易在各口岸實驗室推廣。
[0012] 該項檢測平臺和方案還可以推廣至腸道傳染病、蟲媒傳染病等病原譜篩查，具有 廣泛的應用領域。
【附圖說明】
[0013]圖1是8組雙重焚光定量RT_PCR(reverse transcription PCR，逆轉錄PCR)陽性質 控品的擴增曲線。
[0014]圖2是A組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[0015]圖3是B組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[0016]圖4是C組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[00Π]圖5是D組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[0018]圖6是E組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[0019]圖7是F組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[0020]圖8是G組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[0021]圖9是Η組雙重熒光定量RT-PCR陽性質控品的擴增曲線。
[0022]圖10是RSV樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0023]圖11是HEV樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0024]圖12是NL63樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0025]圖13是HKU1樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0026]圖14是229E樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0027]圖15是0C43樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0028]圖16是PIV1樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0029]圖17是PIV2樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0030]圖18是hRV樣本及陽性質控品擴增曲線。
[00311圖19是PIV3樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0032]圖20是hBoV樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0033]圖21是hMPV樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0034]圖22是MP樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0035]圖23是CP樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0036]圖24是AdV樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0037]圖25是LP樣本及陽性質控品擴增曲線。
[0038]圖26是在96孔板中的分布組合方式示意圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面結合具體實例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員 應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0040]為了能快速準確完成對項呼吸道癥候群病原體篩查并節約成本，本發明下述實施 例意在開發出一種能同時能快速檢測呼吸道16項病原體的雙重熒光PCR檢測試劑盒。該方 法主要依賴采用預分裝技術和雙重熒光PCR檢測的方法來實現。
[0041]本發明下述實施例中將詳述描述一種能同時能快速檢測呼吸道16項病原體的雙 重熒光PCR檢測試劑盒，包括:預分裝PCR反應液，RT-PCR酶，1個陽性質控品和1個陰性質控 品。
[0042]其中，所述預分裝PCR反應液的設計組合:該項篩查技術由8個雙重熒光探針PCR反 應完成，其組合是A組（呼吸道合胞病毒和腸道病毒HEV)、B組（冠狀病毒NL63和冠狀病毒 HKU1)、C組(冠狀病毒229E和冠狀病毒0C43)、D組（副流感病毒1型和2型）、E組(鼻病毒和副 流感病毒3型）、F組(人博卡病毒和人偏肺病毒）、G組(肺炎支原體和肺炎衣原體）、H組(腺病 毒和軍團菌）。在96孔板中的分布按以下組合方式：
[0043]其中1-10列代表10個待測樣本，11和12列分別代表陽性和陰性對照。
[0044] 所述PCR反應液設有用于檢測呼吸道合胞病毒、腸道病毒、冠狀病毒NL63、冠狀病 毒HKU1、冠狀病毒229E、冠狀病毒0C43、副流感病毒1型、副流感病毒2型、鼻病毒、副流感病 毒3型、人博卡病毒、人偏肺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、腺病毒和嗜肺軍團菌的引物和 TaqMan(-種RNA探針)探針，其中用于呼吸道合胞病毒檢測的引物序列分別為SEQIDN0:1 和SEQIDN0:2，TaqMan探針序列為SEQIDN0:3,熒光標記為FAM;用于腸道病毒檢測的引 物序列分別為SEQIDN0:4和SEQIDN0:5，TaqMan探針序列為SEQIDN0:6,熒光標記為 HEX;用于冠狀病毒NL63檢測的引物序列分別為SEQIDN0:7和SEQIDN0:8，TaqMan探針序 列為SEQIDN0:9,熒光標記為FAM;用于冠狀病毒HKU1檢測的引物序列分別為SEQIDNO: 10和SEQIDNO: 11，TaqMan探針序列為SEQIDNO: 12,熒光標記為HEX;用于冠狀病毒229E 檢測的引物序列分別為SEQIDNO: 13和SEQIDNO: 14，TaqMan探針序列為SEQIDNO: 1