專利名稱：一種呼吸道病原體的實時熒光聚合酶鏈式反應檢測方法
技術領域：
本發明涉及七種呼吸道傳染病的病原體實時熒光聚合酶鏈式反應(PCR)檢測方法及其試劑盒。這七種病原體包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腸道病毒(EV)，肺炎支原體(MP)，肺炎衣原體(CP)，呼吸道腺病毒(ADV)。
背景技術：
呼吸道病原體主要通過呼吸道侵入人體，并隨呼吸道分泌物向外傳播，侵入另一易感機體引起呼吸道傳染性疾病。呼吸道病原體主要通過空氣(飛沫、塵埃)傳播，而目前尚缺乏有效的大面積空氣消毒方法，故其預防重點在于早期發現和在流行前的預防。呼吸道病原體主要包括病毒、致病菌、支原體、衣原體等。主要有Influenza.A，Influenza.B，RSV，EV，M.P，C.P，ADV等。呼吸道傳染病的臨床表現不特異，上呼吸道感染性疾病的癥狀主要包括咳嗽、流涕、咽喉不適等呼吸道局部癥狀和發熱、乏力、頭痛、肌肉酸痛等全身癥狀；下呼吸道感染性疾病的初期可見咳嗽、鼻塞等非特異的臨床表現。多種病毒性肺炎之間依靠臨床癥狀幾乎無法區別，其和衣原體肺炎、支原體肺炎鑒別也比較困難。臨床上常用的血液學檢查、影像學檢查等在相當程度上不能確定所感染的病原體。由于呼吸道傳染病的臨床表現和常用的輔助檢查缺乏明顯的特異性，因此存在著在疾病早期病原體診斷不明確的危險因素，從而存在著疾病早期濫用抗生素、生病期延長而增加患者痛苦和經濟負擔的客觀因素。
實時熒光PCR檢測方法采用特異性的核酸序列進行呼吸道傳染病的病原學診斷，有利于在疾病癥狀出現的早期就確定引起呼吸道傳染病的病原體。有利于在疾病早期針對性進行有效的抗生素治療，縮短呼吸道傳染病的病程，減輕患者的痛苦和經濟負擔。對呼吸道傳染病及時而準確的病原學診斷，有利于對呼吸道傳染病的流行病學進行研究，指導在疾病流行的初期進行預防，從而能極大程度的降低呼吸道傳染病的流行范圍和程度，降低呼吸道傳染病對社會的危害。流行性感冒曾發生過多次全球性大流行，第一次世界大戰末期(1918～1919)的流行，導致5億人患病，死者2000萬；1946～1947年、1957～1958年與1968～1969年又曾三度流行于全世界，之后由于傳染病的預防和控制體制和機構的不斷健全，從而極大程度的控制了流感的流行。然而對于一些易感群體(如老人，兒童等)，呼吸道傳染病的發病率仍然居高不下，據2004年WHO的報告顯示，發展中國家臨床肺炎的發病率為0.29次/兒童-年(e/cy)，全球95％以上低齡兒童的臨床肺炎發生在發展中國家。
目前臨床上常用的呼吸道病原體的檢測方法主要是通過檢測特異性抗體的方法進行的。由于病原體從進入機體進行復制和抗原刺激到產生抗體需要一定的時間，這種方法仍不能滿足早期病原體確診的需要，從而不能滿足早期進行積極治療的臨床需要。熒光實時PCR檢測方法通過不同病原體的特異性核酸序列，來對呼吸道傳染病進行病原學診斷，在疾病發生發展的早期就可以進行診斷，從而具有顯而易見的臨床診斷意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種常見呼吸道病原體的早期、有效而簡便的檢測方法，涉及的病原體包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腸道病毒(EV)，肺炎支原體(MP)，肺炎衣原體(CP)，腺病毒(ADV)。本發明的另一目的在于提供用于該方法的試劑盒。
本發明在大量分析現有的在GenBank登錄的上述七種呼吸道病原體不同型別的基因組全序列的基礎上，找出這七種病原體各自所特異的核酸序列，并根據不同病原體的型別，設計了對各自病原體的大多數型別都具有較高靈敏度的特異性引物和探針，提高了臨床檢測的特異性和靈敏度；這種檢測方法同熒光實時PCR相結合，同時發揮了實時熒光PCR檢測方法快速簡便的性能，實現了本發明的目的。本發明的七種呼吸道病原體的實時熒光PCR檢測方法的技術特征在于，對GenBank中的相關序列進行分析，找出特異性和靈敏度都較高的核酸序列，并使用相關軟件分析并設計引物和探針，利用引物、探針序列的特異性，結合熒光PCR的方法，從咽拭子中提取出呼吸道病原體的核酸，進行PCR擴增實現臨床樣本中病原體的檢測。
對于該檢測方法所配套的試劑盒，所采用的探針和引物的設計顧及到了幾乎所有的型別，探針和引物所選擇的是核酸片段具有明顯的屬特異性。所設計的探針采用熒光素FAM(Carboxyfluorescein，羧基熒光素，吸收波長492nm，發射波長518nm，綠色)作為發光基團，采用MGB(Miner groove binder)或BHQ1(Black Hole Quencher 1)作為淬滅基團，所設計的引物都可以采用相同的退火溫度55℃。
所涉及的七種待檢病原體的核酸序列片段分別為A型流感病毒(Influenza.A)CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATCTCATTTTTCTGGCACGGTCTGCACTAATCCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGTCCTGCTTGCCTGCTTGTGTGTACGGACTTGCAGTGGCCAGTGGATATGAB型流感病毒(Influenza.B)CCAGGGATTGCAGACATTGAAGATCTAACCCTGCTTGCTCGTAGCATGGTCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGAGCAAAGTAGTTCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAATACCTCAACTAGGGTTCAATGTTGAAGAGTACTCTATGGTTGGGTACGAAGCCA呼吸道合胞病毒(RSV)TGAACAACCCAAAAGCATCATTATTATCTTTGACTCAATTTCCTCACTTCTCCAGTGTAGTATTAGGCAATGC腸道病毒(EV)GGCTAATCCTAACTGCGGAGCAGGTACCCACGAGCCAGTGGGCAGCCTGTCGTAATGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCATTTACTCTTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATCACGGAATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATC肺炎支原體(MP)
CCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAACGATGAAGG TCTTTAAGATTGT肺炎衣原體(CP)TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGGCGTGTCAGCCATAACGCCGTGAATACGTTCTCGGGCCTTGTACACAC腺病毒(ADV)ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGG所涉及的七種待檢病原體的引物和探針的序列分別為A型流感病毒引物1TGGCACGGTCTGCACTCA引物2GTACACACAAGCAGGCAAGCA引物3CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATC引物4TCATATCCACTGGCCACGGCAAG探針FAM-CCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGT-BHQ1B型流感病毒引物1ACCCTGCTTGCTCGTAGCAT引物2ATGCTTATGGGAAGAACTACTTTGC引物3CCAGGGATTGCAGACATTGAAGA引物4TGGCTTCGTACCCAACCATAGAGTACT探針FAM-TCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCG-BHQ1呼吸道合胞病毒引物1TGAACAACCCAAAAGCATCATT引物2GCATTGCCTAATACTACACTGGAGAA探針FAM-CTTTGACTCAATTTCCT-MGB腸道病毒引物1TCAATTGTCACCATAAGCAGCCA引物2GATGGCCAATCCAATAGCTATATGG引物3GGCTAATCCTAACTGCGGAGCA引物4ACTCTGCAGCGGAACCGACT探針FAM-CTTTGGGTGTCCGTGTTT-MGB腺病毒引物1ATGGCCACCCCTTCGATGA引物2CCCGGACTCAGGTACTCCGA探針FAM-TACATGCACATCGCCGG-MGB
肺炎支原體引物1GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT引物2ACAATCTTAAAGACCTTCATCGTTCA探針FAM-TTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGA-BHQ1肺炎衣原體引物1TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGG引物2GTGTGTACAAGGCCCGAGAAC探針FAM-TGTCAGCCATAACGCCGTGAAT-BHQ1本發明的熒光PCR反應對不同的呼吸道病原體有一定的差異，對于RSV，EV，Influenza.A和Influenza.B四種病原體所使用的PCR反應程序是RT-PCR一步法。RT-PCR反應體系中含有相應的RT-PCR反應緩沖液(包括1×RT-PCR反應緩沖液，dNTP，特異性探針以及和各個探針所對應的一對或兩對PCR引物)和RT-PCR酶(包括Taq DNA聚合酶，反轉錄酶)。所述的1×RT-PCR反應緩沖液包括50mmol/LTris-HCl，pH 9.2，50mmol/L KCl，4.0mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT；dNTP為0.3mmol/L；探針為0.12μmol/L；巢式PCR內引物為0.6μmol/L；巢式PCR外引物為0.06μmol/L。RT-PCR酶中包括TaqDNA聚合酶1U/0.7μl和反轉錄酶100U/0.7μl。對于四種RNA病原體均可以采用相同的RT-PCR反應條件第一步37℃ 45min，94℃ 1min；第二步94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循環；第三步94℃5s，55℃ 35s，40次循環；PCR反應的第三步55℃時進行FAM熒光檢測。
對于ADV，MP和CP三種病原體，所需的PCR反應體系中含有相應的PCR反應緩沖液(包括1×，dNTP，特異性探針以及和各個探針所對應的一對上、下游引物)和Taq酶。所述的1×PCR反應緩沖液包括10mmol/L Tris-HCl pH 9.2，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，5％甘油；dNTP終濃度為0.2mmol/L；探針終濃度為0.12μmol/L；一對PCR上、下游引物終濃度都為0.6μmol/L；Taq酶中包括Taq DNA聚合酶1U/0.2μl。對于三種DNA病原體均可以采用相同的PCR反應條件第一步94C 1min；第二步94℃15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循環；第三步94℃ 5s，55℃ 35s，40次循環；PCR反應的第三步55℃時進行FAM熒光檢測。在ASV，EV，Influenza.A或Influenza.B需要和ADV，MP或CP同時檢測的情況下，則可以采用前者的RT-PCR反應條件，即對于需要進行同一或不同樣本的多種病原體檢測，可以同時進行。
本發明所檢測的七種呼吸道病原體核酸樣本的獲得通過咽拭子采樣的方法獲得，詳見具體實施方式
部分。本發明的測定結果判斷是正對應的，即針對樣本所檢測的病原體有陽性擴增就可以判斷為此病原體感染。如果同一樣本的多種病原體檢測有兩個或兩個以上的擴增則判斷為相應病原體的混合感染。
和現有的呼吸道檢測方法相比較，本發明具有明顯的優勢本發明對臨床樣本的檢測從樣本的收集、核酸的抽提、反應體系的配制、程序的運行到得出結果，可以在4個小時內完成，有利于臨床標本的快速檢測；所選用的引物和探針均顧及到流行的主要型別，并且是各個病原體的特異性核酸片段，因此具有高的靈敏度和特異性，有利于臨床上的早期診斷；檢測的整個流程主要采用的儀器設備是全自動熒光定量PCR儀、微型離心機以及各種型號的移液器等，主要的試劑均來源于本發明所包括的試劑盒，實驗流程少，操作簡便易行，消耗費用低；而且本發明的方法從PCR到檢測結果的獲得采用全封閉式的檢測，能有效的避免PCR產物的環境污染。
具體實施例方式
實施例1本發明呼吸道病原體的實時熒光PCR測定方法及其試劑盒。
1試劑盒組成(1)DNA提取試劑包括A液6mol/L異硫氰酸胍，30mmol/L檸檬酸鈉，0.58％十二烷基磺酸鈉，1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，2％糖原；B液異丙醇；C液75％乙醇水溶液；樣本稀釋液ddH2O。
(2)PCR反應試劑包括每種病原體各自的PCR反應液和酶。
對于RSV，EV，Influenza.A或Influenza.B的PCR反應液(20μl每人份，檢測時加入提取的病原體模板5μl，反應液終體積是25μl)組分如下5μl的5×RT反應液(250mmol/L Tris-HCl，pH 9.2，250mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，50mmol/L DTT)；終濃度為0.3mmol/L的dNTP；0.12μmol/L的探針；0.6μmol/L的巢式PCR內引物；0.06μmol/L的巢式PCR外引物；用水填充體積到20μl。酶是RT-PCR酶(Taq DNA聚合酶1U/0.7μl，反轉錄酶100U/0.7μl)。
對于ADV，M.P或C.P的PCR反應液(20μl每人份，檢測時加入提取的病原體模板5μl，反應液終體積是25μl)組分如下2.5μl的1×PCR反應緩沖液(包括10mmol/L Tris-HCl，pH 9.2，50mmol/LKCl，2.5mmol/L MgCl2，5％甘油)；終濃度為0.2mmol/L的dNTP；0.12μmol/L的探針；一對PCR上、下游引物終濃度分別為0.6μmol/L；Taq酶中包括Taq DNA聚合酶1U/0.2μl。
(3)陽性對照和陰性對照試劑盒包括有所涉及的七種呼吸道病原體各自的強陽性對照(Ct＜25)和臨界陽性對照(Ct＜30)和陰性對照(Ct＝none)。
2.呼吸道病原體的熒光PCR檢測(1)臨床標本采集、保存及運輸適用于咽拭子標本采集。采集時以清晨為宜。用清水漱口，由檢查者用壓舌板輔助，將咽拭子越過舌根，到達咽峽部的病變處，反復涂抹數次，取出時避免接觸舌及口腔粘膜等處，將取樣后的棉拭子放入約1ml的生理鹽水中充分洗滌，然后貼壁擠干，丟棄棉拭子。待測標本在4℃保存不應超過24小時，-20℃保存不應超過48小時；-80℃保存不超過三個月。標本運送應采用冰壺或加冰的泡沫箱。
(2)標本處理將待測標本13000rpm離心2分鐘后棄上清，留沉淀物及底部溶液共50μl在管內，加抽提A液200μl，蓋好蓋，用旋渦振蕩器充分混勻沉淀物后靜止3分鐘；開蓋加抽提B液250μl，顛倒混勻，臺式離心機13000rpm離心10分鐘，去上清，盡量吸干或扣干；再加抽提C液200μl，顛倒混勻，13000rpm離心5分鐘，吸去上清(用加樣槍一次吸干，不要碰到沉淀物)，室溫放置5分鐘或50℃放置2～5分鐘晾干；加入樣本稀釋液15μl混懸沉淀物，13000rpm離心1分鐘，取上清作PCR(因病毒RNA極易降解，請在2小時內進行PCR，如當天不使用，請立即于-80℃保存)。
(3)PCR擴增取出PCR反應液、RT-PCR酶，室溫融化后取相應份數(反應液20μl/T，Taq酶0.2μl/T或RT-PCR酶0.7μl/T)混勻，向每個孔內加入混勻的反應液20μl，加入抽提好的模板或對照5μl，蓋好蓋，將反應管置于全自動熒光PCR檢測儀中，參照儀器操作說明設定陰陽性對照、待檢樣品參數進行PCR反應，記錄好樣品擺放順序。反應程序設定第一步94℃ 1min或37℃ 45min，94℃ 1min；第二步94℃ 15sec，55℃ 15sec，72℃ 20sec，5個循環；第三步94℃ 5sec，55℃ 35sec，40個循環。熒光數設定為FAM，反應程序的第三步55℃時開始檢測。
(4)結果判定綜合分析儀器給出的各項數據，設定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline)，使儀器給出正確的結果。陰性對照Ct值為none，強陽性對照的Ct值應小于等于30.0，臨界陽性對照的Ct值應小于等于30.0。待檢樣本的Ct值小于等于35.0為陽性，Ct值大于35.0為陰性。
(5)注意事項實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴格按操作步驟執行。
整個實驗操作過程以及PCR實驗室的軟硬件設施應符合衛生部頒布《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》、《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范》等法規的要求。
權利要求
1.一種呼吸道病原體的實時熒光聚合酶鏈式反應檢測方法，包括以下步驟a.根據七種病原體的待檢靶基因特異性核酸序列設計特異性的引物；b.根據七種病原體的待檢靶基因特異性核酸序列位于引物之間的序列設計，合成各自的熒光探針；c.使用步驟a中的引物和步驟b中的探針及其他PCR或RT-PCR成份組成PCR或RT-PCR反應液；d.從待檢樣本中提取DNA或RNA，加入到PCR主反應液或RT-PCR主反應液中；e.將反應管放在自動熒光PCR儀中進行檢測；f.檢測程序結束后，綜合分析儀器給出的各項數據，設定合理的閾值(Threshold)和基線(Baseline)，使儀器給出正確的結果，進行結果判斷。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，這七種呼吸道病原體包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腸道病毒(EV)，腺病毒(ADV)，肺炎支原體(MP)，肺炎衣原體(CP)。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物和步驟b中的探針序列如下引物1TGGCACGGTCTGCACTCA引物2GTACACACAAGCAGGCAAGCA引物3CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATC引物4TCATATCCACTGGCCACGGCAAG探針FAM-CCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGT-BHQ1。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物和步驟b中的探針序列如下引物1ACCCTGCTTGCTCGTAGCAT引物2ATGCTTATGGGAAGAACTACTTTGC引物3CCAGGGATTGCAGACATTGAAGA引物4TGGCTTCGTACCCAACCATAGAGTACT探針FAM-TCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCG-BHQ1。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物和步驟b中的探針序列如下引物1TGAACAACCCAAAAGCATCATT引物2GCATTGCCTAATACTACACTGGAGAA探針FAM-CTTTGACTCAATTTCCT-MGB。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物序列如下引物1TCAATTGTCACCATAAGCAGCCA引物2GATGGCCAATCCAATAGCTATATGG引物4ACTCTGCAGCGGAACCGACT探針FAM-CTTTGGGTGTCCGTGTTT-MGB。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物序列如下引物1ATGGCCACCCCTTCGATGA引物2CCCGGACTCAGGTACTCCGA探針FAM-TACATGCACATCGCCGG-MGB。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物序列如下引物1GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT引物2ACAATCTTAAAGACCTTCATCGTTCA探針FAM-TTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGA-BHQ1。
9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物序列如下引物1TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGG引物2GTGTGTACAAGGCCCGAGAAC探針FAM-TGTCAGCCATAACGCCGTGAAT-BHQ1。
10.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e中的PCR反應條件是第一步37℃ 45min，94℃ 1min；第二步94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循環；第三步94℃ 5s，55℃ 35s，40次循環；PCR反應的第三步進行FAM熒光檢測。
11.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e中的PCR反應條件是第一步94℃ 1min；第二步94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循環；第三步94℃ 5s，55℃ 35s，40次循環；PCR反應的第三步進行FAM熒光檢測。
12.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟f中的結果判斷待檢樣本的Ct值小于等于35.0為陽性，Ct值大于35.0為陰性。
13.一種用于呼吸道病原體熒光PCR檢測的試劑盒，包括以下內容a.這七種呼吸道病原體包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腸道病毒(EV)，腺病毒(ADV)，肺炎支原體(MP)，肺炎衣原體(CP)；b.每種呼吸道病原體熒光PCR檢測試劑盒分別包裝，分別命名為A型流感病毒(Influenza.A)熒光PCR檢測試劑盒，B型流感病毒(Influenza.B)熒光PCR檢測試劑盒，呼吸道合胞病毒(RSV)熒光PCR檢測試劑盒，腸道病毒(EV)熒光PCR檢測試劑盒，腺病毒(ADV)熒光PCR檢測試劑盒，肺炎支原體(MP)熒光PCR檢測試劑盒，肺炎衣原體(CP)熒光PCR檢測試劑盒；c.每種呼吸道病原體熒光PCR檢測試劑盒的成份除都含有核酸提取A液，核酸提取B液，核酸提取C液和樣本稀釋液，每種呼吸道病原體熒光PCR檢測試劑盒還含有各自的PCR或RT-PCR反應液，陽性對照，陰性對照和熒光PCR反應所需的Taq酶或RT-PCR酶。
14.按照權利要求13所述的檢測試劑盒，試劑盒提供的PCR反應液的其他組分為50mmol/LTris-HCl，pH 9.2；50mmol/L KCl；4.0mmol/L MgCl2；10mmol/L DTT；0.3mmol/L dNTP。
15.按照權利要求13所述的檢測試劑盒，試劑盒提供的PCR反應液的其他組分為10mmol/LTris-HCl，pH 9.2，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，5％甘油；0.2mmol/L dNTP。
全文摘要
本發明涉及一種呼吸道病原體的實時熒光聚合酶鏈式反應檢測方法及其試劑盒。其方法特征在于，對GenBank中登錄的相關的呼吸道病原體(包括A型流感病毒，B型流感病毒，呼吸道合胞病毒，腸道病毒，腺病毒，肺炎支原體，肺炎衣原體)的基因組核酸序列進行分析，根據各種病原體特異性和保守性高的堿基的聚集區域設計引物和探針；使用本發明所提供的試劑盒，從咽拭子樣品提取病原體核酸；在引物和探針的存在下，在熒光PCR儀中，對提取的病原體核酸進行PCR擴增或RT－PCR擴增，從而實現呼吸道病原體的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1746319SQ20051003740
公開日2006年3月15日 申請日期2005年9月22日 優先權日2005年9月22日
發明者周榮, 黃茜華, 王海 申請人:廣州華銀醫藥科技有限公司