試劑盒及其在病原體檢測中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物檢測，具體地，本發明涉及包含序列的試劑盒、病原體檢測方法 及裝置。
【背景技術】
[0002] 孕前篩查是主要針對生殖系統和遺傳因素所做的檢查，傳統的孕前感染篩查主要 包括兩部分：1)生殖系統：通過白帶常規篩查滴蟲、霉菌、支原體衣原體感染、陰道炎癥，以 及淋病、梅毒等性傳播性疾病；2) TORCH檢測：T0指弓形體（Toxoplasma gondii)，R指風疹 病毒（Rubella Virus)，C是指巨細胞病毒（Cytomegalovirus)，Η指單純痛瘡病毒（Herpes Simplex Virus)，分I型和II型），0指其它。
[0003] 目前，在我國最方便、最常用的TORCH篩查方法是采用ELISA酶免診斷技術檢測人 體血清中的特異性IgM、IgG抗體。ELISA試劑因其穩定、靈敏度高、特異性強、成本低等優 點而在普通實驗室中廣泛采用，但一般用來做定性，不能定量。TORCH定量檢測則采用化學 發光法，通過方法學評價，表明化學發光法CLIA測定的靈敏度高，批內和批間變異小，且具 有良好的抗干擾能力，可去除標本中可能存在的病毒IgG抗體以及類風濕因子等的干擾， 適用于常規臨床工作。傳統的檢測手段在臨床診斷中已發揮了巨大的作用，但仍存在一些 不足之處，例如耗時、不能一次性同時檢出等等。
【發明內容】
[0004] 依據本發明一方面提供一種試劑盒，其包括如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2, SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8，SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO: 14以及SEQ ID NO :15和SEQ ID NO :16所示的8對引物序列中的至少2對。
[0005] 依據本發明的另一方面提供一種上述試劑盒在病原體擴增和/或檢測中的用途， 病原體包括弓形蟲、巨細胞病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、梅毒螺旋體、丙肝病毒、人 類免疫缺陷病毒和風瘆病毒。
[0006] 依據本發明的再一方面提供一種病原體檢測方法，病原體包括弓形蟲、巨細胞病 毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、梅毒螺旋體、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒和風疹病毒中 的至少一種，該方法包括：（1)提取待測樣本核酸；(2)對（1)中的核酸中的至少一部分進 行擴增，獲得擴增產物，擴增利用本發明一方面提供的試劑盒進行；（3)對（2)中的擴增產 物進行序列測定，獲得測定序列；(4)利用（3)中的測定序列，確定待測樣本中包含的病原 體種類。該方法還包括：（5)利用（4)的確定結果，計算所述確定的各種病原體的豐度，將 每種病原體的豐度與該種病原體的不致病豐度進行比較，兩者有顯著性差異則確定宿主感 染該種病原體。
[0007] 依據本發明的又一方面還提供一種病原體檢測裝置，所述病原體包括弓形蟲、巨 細胞病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、梅毒螺旋體、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒和風疹 病毒中的至少一種，該裝置包括:A.核酸提取單元，用于提取獲得待測樣本核酸；B.擴增單 元，與A單元相連，用于對來自A的核酸的至少一部分進行擴增，獲得擴增產物，所述核酸中 的至少一部分包括能夠與本發明一方面提供的試劑盒中的至少1對引物序列結合上的核 酸序列，擴增利用本發明一方面的試劑盒進行；C.序列測定單元，與B單元相連，用于對接 收自B單元的擴增產物進行序列測定，獲得測定序列；D.病原體種類確定單元，與C單元相 連，用于利用接收自C單元的測定序列，確定待測樣本包含的病原體種類。該裝置還包括： E.病原體感染判定單元，與D單元相連，用于利用接收自D單元的結果，計算所述確定的各 種病原體的豐度，將每種病原體的豐度與該種病原體的不致病豐度進行比較，兩者有顯著 性差異則判定宿主感染該種病原體。該裝置能夠用以執行完成本發明一方面的病原體檢測 方法。
[0008] 本發明的試劑盒、方法和/裝置旨在開發一種基于新一代測序技術的用于輔助 臨床診斷的孕前感染篩查技術，可一次性地將弓形蟲（Τ0Χ)、巨細胞病毒（CMV)、乙型肝炎 病毒（HBV)、單純皰疹病毒（HSV)、梅毒螺旋體（TP)、丙肝病毒（HCV)、人類免疫缺陷病毒 (HIV)、風疹病毒（RV)八種可造成生殖系統等感染的病原體同時檢出。
【附圖說明】
[0009] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中 ：
[0010] 圖1是本發明的一個【具體實施方式】中的病原體檢測流程；
[0011] 圖2是本發明的一個【具體實施方式】中的樣本CMV檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0012] 依據本發明的一種實施方式，提供一種試劑盒，包括如SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 : 2, SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9 和 SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14以及SEQ ID NO :15和SEQ ID NO :16所示的8對引物序列中的至少2對。 根據本發明的一個具體的實施方式，試劑盒包括上述8對引物序列中的至少3對。根據本 發明的一個具體的實施方式，該試劑盒包括上述8對引物序列中的至少4對。根據本發明 的一個具體的實施方式，該試劑盒包括上述8對引物序列中的至少5對。根據本發明的一 個具體的實施方式，該試劑盒包括上述8對引物序列中的至少6對。根據本發明的一個具 體的實施方式，該試劑盒包括上述8對引物序列中的至少7對。根據本發明的一個具體的 實施方式，該試劑盒包括上述8對引物序列。利用該試劑盒能夠多重擴增出樣本包含的病 原體，一次測定多種病原體檢測多種病原體。8對引物序列如表1所示。
[0013] 表 1
[0014]
[0015] 依據本發明的另一個實施方式，提供本發明一方面的試劑盒在病原體擴增和/或 檢測中的用途，所述病原體包括弓形蟲、巨細胞病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、梅毒螺 旋體、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒和風疹病毒。
[0016] 依據本發明的再一個實施方式，提供一種病原體檢測方法，所述病原體包括弓形 蟲、巨細胞病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、梅毒螺旋體、丙肝病毒、人類免疫缺陷病毒 和風疹病毒中的至少一種，方法包括以下步驟：
[0017] (1)提取待測樣本核酸。
[0018] 在本發明的一個【具體實施方式】中，待測樣本為血液、血清或血漿樣本，血液/全血 樣通過離心等處理能夠獲得血漿或血清樣本，提取血漿/血清中的游離核酸，該游離核酸 是宿主和微生物的混合核酸，為DNA片段或RNA片段。這邊的宿主可以是人也可以是其它 哺乳動物。
[0019] (2)擴增。
[0020] 對步驟（1)中的核酸中的至少一部分進行擴增，獲得擴增產物，所述擴增利用本 發明一方面的試劑盒進行。當在一個反應體系中，利用本發明一方面的試劑盒中的多對引 物序列進行多重PCR，各對引物能夠混合在同一個反應體系中同時擴增多種微生物核酸片 段。
[0021] (3)序列測定。
[0022] 對（2)中的擴增產物進行序列測定，獲得測定序列。序列測定可以通過測序進 行，比如可選用的測序方法根據來自的測序平臺包括但不限于BGISEQ1000、BGISEQ100、 Illumina/Solexa、ABI/SOLiD和Roche 454,依據所選用的測序方法進行相應的文庫制備， 進行單端或雙端測序，獲得多條測序序列，即讀段（reads)。根據本發明的一個具體實施方 式，獲得讀段后，還對讀段進行過濾，去除重復的、被接頭污染（含接頭序列）和質量值低于 25的讀段。
[0023] (4)確定待測樣本包含的病原體種類。
[0024] 利用（3)中的測定序列，確定待測樣本中包含的病