一種固定化茶葉過氧化氫酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種固定化茶葉過氧化氫酶的制備方法，屬于生物活性物質的分離提取技術領域。
【背景技術】
[0002]過氧化氫酶是一種除氧酶，又稱觸酶，是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，是以過氧化氫為底物，通過催化一對電子的轉移而最終將其分解為水和氧氣，其系統名稱是Η2θ2:Η2θ2氧化還原酶，國際酶學委員會的編號為ECl.11.1.6。過氧化氫酶在食品工業中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的過氧化氫。過氧化氫酶也被用于食品包裝，防止食物被氧化。在紡織工業中，過氧化氫酶被用于除去紡織物上的過氧化氫，以保證成品是不含過氧化物的。它還被用在隱形眼鏡的清潔上:眼鏡在含有過氧化氫的清潔劑中浸泡后，使用前再用過氧化氫酶除去殘留的過氧化氫。過氧化氫酶在美容業中的使用:一些面部護理中加入了該酶和過氧化氫，目的是增加表皮上層的細胞氧量。
[0003]酶的純化工作非常復雜，除了要保證純度外，酶產品還必須保持其生物活性。純化工藝必須能夠每次都能產生相同數量和質量的酶，重復性良好。這就要求應用適應性非常強的方法而不是用能得到純酶的最好方法去純化酶。在實驗室條件下的好方法卻可能在大規模生產應用中失敗，因為后者要求規模化，且在每日的應用中要有很好的重復性。
[0004]目前，國內外主要是從豬、牛等動物肝臟中提取純化而得，如CN1436846提出了一種由動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，該方法經過將動物肝臟在酸性條件下粗提、高速離心、硫酸銨沉淀、熱變性等四個步驟最后得到過氧化氫酶溶液，但是該方法中要用到大量的飽和度45 %的硫酸銨，在生產中容易造成大量無機鹽的污染，不是環境友好型生產工藝，而且該方法得到的酶的活性不是很高，并只得到酶溶液而不是干品。
[0005]除此以外，現市售過氧化氫酶產品基本為動物肝過氧化氫酶和微生物過氧化氫酶共存，微生物發酵生產過氧化氫酶基本由國外知名大公司生產，市售價格較高，而且均不屬于食品級過氧化氫酶。肝臟提取過氧化氫酶在國內已經工業化，但是傳統提取工藝中加入有機溶劑和無機鹽，使后續酶的純化難度增加，產品純度不高，酶活不穩定，得率低且生產周期長，除此以外傳統干燥技術對酶蛋白破壞嚴重，生產產品也不屬于食品級過氧化氫酶。
[0006]因此，通過改進傳統生產工藝，最終得到產物得率高、酶活性穩定，且生產周期短、純度高的食品級過氧化氫酶產品是很重要的。
【發明內容】
[0007]本發明主要解決的技術問題:針對目前傳統的過氧化氫酶在提取的過程中需加入有機溶劑和無機鹽，不僅造成了環境的污染，而且使得后續得到的酶活不穩定，得率低且生產周期長的現狀，提供了一種通過從茶葉中提取過氧化氫酶，用甘三脂對其進行包覆固定化，從而得到固定化茶葉過氧化氫酶的制備方法。該方法不僅在制備過程中避免了無機鹽的使用，是環境友好型生產工藝，而且制得的固定化茶葉過氧化氫酶活性穩定、得率高，可用于食品加工，具有很好的緩釋效果。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是:
(1)稱取100?200g新鮮茶葉用去離子水沖洗干凈，瀝干水分后用剪刀將其剪碎成I?3cm的碎片，放入2L玻璃瓶中，加入500?700mL pH為6?7的磷酸緩沖液和15?20g聚乙烯吡咯烷酮，放入高速勻漿機中，以20000?25000r/min的轉速高速勻漿I?3min;
(2)勻漿結束后，將漿液移入燒杯中，放置在冰水浴中，在4?6°C下靜置I?2h，并用注射器吸取150?200mL上層液體放入臥式離心機，以12000?15000r/min的轉速離心5?15min，分離得到上清液，于4?6°C下保存；
(3)將上述得到上清液過凝膠柱進行過濾層析，用pH為7?8的磷酸緩沖液進行洗脫，洗脫流速為I?3L/h，收集層析洗脫液得到純化后的過氧化氫酶母液；
(4)量取200?300mL乙酸乙酯裝入500mL三口燒瓶中，加入50?60g三棕櫚酸甘三酯和7?8g聚乳酸以及2?3g輕基乙酸，放入漩禍振蕩器中，以10?20W的功率，300?500rmp/min的速率振蕩乳化20?30min制得預乳液；
(5)將預乳液再移入超聲乳化機中，加入10?20g卵磷脂，將50?70mL上述過氧化氫酶母液逐滴滴入混合乳液中，控制滴加速度使其20?30min內滴加完畢，以200?300W的功率超聲乳化10?20min，制得雙乳液；
(6)將上述制得的雙乳液放入旋轉蒸發器中，升溫至80?90°C，旋蒸去除乙酸乙酯后得濃縮液，將其放入冷凍離心機中，在4?5°C下離心30?50min，離心轉速為14000?16000r/min，分離得到固定化過氧化氫酶脂質體，用冷凍干燥機干燥后即得一種固定化茶葉過氧化氫酶。
[0009]本發明制得的過氧化氫酶為近乎白色至淺棕黃色的粉末;溶于水，不溶于乙醇、氯仿和乙醚;酶活達到11000U/mg以上;最適pH值為7.0?7.2。
[0010]本發明的應用方法是:在使用過程中，將本發明制得的固定化茶葉過氧化氫酶放入待制造奶酪的牛奶中，其中每I?3L牛奶中加入2?4g過氧化氫酶，充分混合，常溫下靜置I?3h即可。經檢測，通過放入過氧化氫酶使得制造奶酪的牛奶中的過氧化氫得到了有效去除，去除率達到了85%以上。
[0011]本發明的有益效果是:
(1)本發明方法工藝簡單，易于實施，便于推廣；
(2)本發明所述方法提取得到的過氧化氫酶酶活至少達到11000U/mg以上，產品回收率達到25%以上，均高于現有的從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，適合工業化生產的要求；
(3)本發明在制備過程中避免了無機鹽的使用，是環境友好型生產工藝，具有較好的穩定性，最終制得的過氧化氫酶可用于食品加工，具有很好的緩釋效果。
【具體實施方式】
[0012]首先稱取100?200g新鮮茶葉用去離子水沖洗干凈，瀝干水分后用剪刀將其剪碎成I?3cm的碎片，放入2L玻璃瓶中，加入500?700mL pH為6?7的磷酸緩沖液和15?20g聚乙烯吡咯烷酮，放入高速勻漿機中，以20000?25000r/min的轉速高速勻漿I?3min;然后勻漿結束后，將漿液移入燒杯中，放置在冰水浴中，在4?6°C下靜置I?2h，并用注射器吸取150?200mL上層液體放入臥式離心機，以12000?150001'/111；[11的轉速離心5?15111；[11，分離得到上清液，于4?6°C下保存;將上述得到上清液過凝膠柱進行過濾層析，用pH為7?8的磷酸緩沖液進行洗脫，洗脫流速為I?3L/h，收集層析洗脫液得到純化后的過氧化氫酶母液;隨后量取200?300mL乙酸乙酯裝入500mL三口燒瓶中，加入50?60g三棕櫚酸甘三酯和7?8g聚乳酸以及2?3g羥基乙酸，放入漩渦振蕩器中，以10?20W的功率，300?500rmp/min的速率振蕩乳化20?30min制得預乳液;接下來將預乳液再移入超聲乳化機中，加入10?20g卵磷脂，將50?70mL上述過氧化氫酶母液逐滴滴入混合乳液中，控制滴加速度使其20?30min內滴加完畢，以200?300W的功率超聲乳化10?20min，制得雙乳液;最后將上述制得的雙乳液放入旋轉蒸發器中，升溫至80?90°C，旋蒸去除乙酸乙酯后得濃縮液，將其放入冷凍離心機中，在4?5°C下離心30?50min，離心轉速為14000?16000r/min，分離得到固定化過氧化氫酶脂質體，用冷凍干燥機干燥后即得一種固定化茶葉過氧化氫酶。
[0013]實例I
首先稱取10g新鮮茶葉用去離子水沖洗干凈，瀝干水分后用剪刀將其剪碎成Icm的碎片，放入2L玻璃瓶中，加入500mL pH為6的磷酸