一種固定化菌劑及其制備方法與應用

一種固定化菌劑及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明提供了一種固定化菌劑及其制備方法與應用。該制備方法包括以下步驟：將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX?2接種到R2A培養基中進行活化培養，得到菌液；將上述菌液接種到固定化培養基中，并向其中加入改性沸石，然后將固定化培養基置于搖床中，在預定的固定化溫度和固定化時間下進行培養，得到液態的固定化菌劑。本發明提供的技術方案操作簡單方便，制備成本低，反應條件溫和，卻具有較高的微生物活性和細胞容量，對石油烴的降解效率可達40.36％。CGMCC No.1233320160408
【專利說明】
一種固定化菌劑及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種固定化菌劑及其制備方法與應用，屬于石油及石油產品污染潮間 帶的生物修復技術領域。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著海上油氣資源勘探、開發的力度日益增大以及海運業、沿海經濟的高 速發展，海洋溢油和污染事故頻頻發生，石油及其產品已經成為僅次于藍藻、赤潮的第二大 海洋污染源。溢油事故發生后，雖物理處理和化學處理可去除大部分表面溢油，然而殘留的 石油烴污染物長期滯留在海岸線環境中，對海洋生態環境及人體健康造成巨大的持久性傷 害。
[0003] 目前，生物修復技術因具有安全高效、操作簡單、不產生二次污染等優點，被公認 為是溢油污染應急處理后的最終處理策略。但目前的生物修復在實際應用中還存在一些問 題，特別是在處理溢油污染潮間帶時往往存在菌體易流失、反應啟動速度慢、優勢菌種濃度 低、與土著競爭處于弱勢及環境耐性差等問題。
[0004] 現已公開的石油污染固定化修復方法，主要是針對土壤、地下水溢油污染，如 〇附01724582八，〇價04388417八，〇價04450597八，〇附04232546八，〇價03920706八等；而針對水 文、地質、氣候等更為復雜、極端的海岸線(或海洋)環境的則相對很少。
[0005] 目前，已公開的應用于溢油污染潮間帶的固定化菌劑僅在CN103923905A和 CN104357435A中有所報道。CN103923905A公開了一種以海藻酸鈉-CaCl2_稻草秸桿活性碳 為載體，通過包埋的方式制備的固定化菌劑，該固定化菌劑可應用于溢油污染海岸線，具有 較高的微生物活性和細胞容量，且具備較高的石油烴降解效率。CN104357435A公開了一種 以海藻酸鈉、聚乙烯醇和活性炭為載體，通過包埋的方式制備的固定化菌劑，該固定化菌劑 在實際岸灘環境可保持良好的活性，其岸灘油污修復效果顯著。
[0006]以上成果對于固定化菌劑的潮間帶溢油污染的修復前景給予了充分的肯定，然 而，這兩種固定化菌劑均以多種材料為載體，通過包埋的方式制備而成，具有制備工藝復 雜、制備成本高、制劑機械強度低、傳質性能差等缺點，限制了該類產品在溢油污染潮間帶 環境中的實際應用。
[0007] 此外，傳統的游離菌劑在海岸線溢油污染修復過程中往往存在海水稀釋速度快、 啟動速度慢、與土著菌種競爭處于劣勢、易被原生動物捕食、對環境條件敏感等問題，無法 有效修復重油溢油污染，特別是重油溢油污染潮間帶。
[0008] 因此，研發更為高效、經濟、有效地固定化菌劑的制備方法尤為重要。

【發明內容】

[0009] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種固定化菌劑及其制備方法與應用。該固 定化菌劑具有較高的微生物活性和細胞容量，對石油烴的降解率可達40.36%。
[0010]為達到上述目的，本發明提供了一種固定化菌劑的制備方法，其包括以下步驟
[0011] a、菌體的活化:將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A 培養基中進行活化培養，得到菌液；
[0012] b、菌體的固定化:將上述菌液接種到固定化培養基中，并向其中加入改性沸石，然 后將固定化培養基置于搖床中，在預定的固定化溫度和固定化時間下進行培養，得到液態 的固定化菌劑。
[0013] 本發明提供的固定化菌劑具有較高的機械強度和傳質性能，能夠有效解決潮間帶 溢油污染過程中添加的菌體易被海水沖刷、環境適應性差等問題，與游離菌相比，具有更高 的石油烴降解效率
[0014] 本發明提供的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2已于2016年4 月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);保藏單位地址:北 京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所;保藏編號為CGMCC No. 12333;分 類命名：迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain。
[0015] 本發明提供的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2是以重質原油 (所述重質原油簡稱重油，是密度為0.92-lg/cm3之間的原油)為單一碳源，從重油污染潮間 帶中篩選得到的，篩選方法能夠重現，其篩選過程包括：
[0016] 取2g重油污染土壤于100mL已滅菌的R2A培養基中，于25°c-30°c、140rpm、避光條 件下搖床富集培養5d;
[0017] 連續兩次富集處理后，取第2次轉接后的培養液按照10、102、103、104、10 5及106倍進 行梯度稀釋，并取103、104、10 5倍稀釋液分別涂布于含lg/L重油的固體海水培養基，于28°C 培養箱中倒置培養5d-7d;
[0018] 根據平板上不同微生物的菌落形態，用接種環分別挑取出來并劃線至固體R2A培 養基平板，繼續于28 °C倒置培養，重復劃線2-3次，即得到迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2;其中，
[0019]以R2A培養基的體積計，所述R2A培養基的原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5g/L胰 蛋白胨、0.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g/L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L磷酸氫二鉀、 0.05g/L七水硫酸鎂，以及0.3g/L丙酮酸鈉，R2A培養基的pH值為7.0;
[0020]所述海水培養基的制備過程為:將1.OmL磷酸鹽緩沖溶液、3.OmL MgS〇4水溶液(濃 度為22 · 5g/L)、1 · OmL CaClwK溶液(濃度為36 · 4g/L)、1 · OmL FeCl3水溶液(濃度為0 · 25g/ L)、1. OmL微量元素溶液，定容至1L，調節pH值為7.4;其中，
[0021 ]所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4;以磷酸鹽緩沖溶液的體積計，所述磷酸鹽緩沖 溶液的原料組成包括8.79g//L的KH2P〇4,21.759g/L的K2HP〇4 · H20,33.48g/L的Na2HP〇4 · 12H20,以及5.09g/L的NH4CI;
[0022] 以微量元素溶液的體積計，所述微量元素溶液的原料組成包括0.1g/L的⑶Cl2 · 6H20,0.425g/L的Mn〇2 · 4H20,0.05g/L的ZnCl2,0.01g/L的NiCl2 · 6H20,0.015g/L的C11SO4 · 5H20,0.01g/L的Na2Mo〇4 · 2H2O,以及0.01g/L的Na2Se〇4 · 2H2O。
[0023] 本發明提供的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2主要生理生化 特征如下：迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的菌落呈球形凸起，橙紅色 不透明，表面光滑，菌落呈圓形，邊緣光滑；菌體為直桿狀，無芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽 性;氧化酶陰性，接觸氧化酶陽性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽陽性，過氧化氫酶陽性，能氧 化乙醇產酸，能發酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等。該菌種耐鹽性好，在ο % -?ο %的鹽度范圍內均 能生存，鹽度>5 %時其生長略受抑制。在模擬海水鹽度下，該菌種10d內對初始濃度為lg/L 的委內瑞拉重油降解效率達20 %以上。
[0024]在上述方法中，優選地，在步驟b中，所述改性沸石的制備方法包括以下步驟：
[0025]步驟一、將天然沸石在200-300°C下灼燒1.5-2h，進行高溫改性；
[0026] 步驟二、將經步驟一處理后的沸石置于濃度為0.01-0.02111〇1/1的圓03水溶液中浸 泡12-24h，進行酸改性;其中，所述沸石與所述HN〇3水溶液的用量之比為lg: 10mL;
[0027] 酸改性結束后，采用去離子水將所述沸石沖洗至表面為中性，并將所述沸石于105 °(：下烘干；
[0028] 步驟三、將經步驟二處理后的沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化 銨水溶液中，于20_30°C下搖床反應12-24h，進行有機改性;其中，所述沸石與所述十六烷基 三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g: 25mL;
[0029] 有機改性結束后，采用去離子水對所述沸石進行沖洗以去除其表面的十六烷基三 甲基溴化銨，并將所述沸石于l〇5°C下烘干，得到改性沸石。
[0030] 在本發明提供的改性沸石的制備方法中，高溫改性能夠高溫改性能夠清除天然沸 石孔穴和孔道堵塞的有機物;酸改性能夠有效清除沸石孔穴和孔道中的Si0 2、Fe203和有機 物等雜質，增加沸石的比表面積和表面活性，從而提高其吸附能力;有機改性一方面能夠降 低沸石的表面能，增強沸石對迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的吸附 能力；另一方面其能夠使固定化菌劑同時具備親水親油性能。
[0031] 采用本發明提供的技術方案制備得到的改性沸石具有吸附速度快、吸附效率高的 特點，其對菌體的吸附量和吸附強度遠遠高于普通未改性的沸石，且制備成本低、操作簡 單、不產生二次污染。
[0032] 此外，本發明提供的改性沸石能夠為微生物提供有利的環境，以抵御土著微生物 的競爭作用和不利潮間帶的侵害作用，所述改性沸石具有多孔結構，能夠大大提高固定化 菌劑的傳質性能，使營養物質更容易被微生物攝取，保障了接種微生物的良好生長，大幅提 高了微生物的活性劑降解效率。
[0033] 在上述方法中，優選地，在步驟b中，菌體的固定化參數為:所述菌液中菌體的菌齡 為70-80h，所述固定化培養基的體積為50mL，所述菌液的接種體積為固定化培養基體積的 3-5 %，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g;所述搖床的轉速為120-180rpm，所述固定化溫 度為28-35°(：，所述固定化時間為70-8011。
[0034] 采用本發明提供的菌體固定化參數能夠保證最終制得的固定化菌劑的親水親油 性能達到動態平衡，以實現最大的原油降解效率。
[0035]在上述方法中，優選地，在步驟b中，所述菌液中菌體的菌齡為75.6h。
[0036] 在上述方法中，優選地，在步驟b中，所述菌液的接種體積為固定化培養基體積的 5%〇
[0037] 在上述方法中，優選地，在步驟b中，所述改性沸石的添加量為1.7g。
[0038]在上述方法中，優選地，在步驟b中，所述固定化時間為75h。
[0039]在上述方法中，優選地，在步驟b中，以固定化培養基的體積計，所述固定化培養基 的原料組成包括3-8g/L牛肉膏、5-15g/L NaCl和5-15g//L蛋白胨;更優選地，以固定化培養 基的體積計，所述固定化培養基的原料組成包括5g/L牛肉膏、lOg/L NaCl和lOg/L蛋白胨。
[0040]在上述方法中，優選地，在步驟b中，所述固定化培養基的pH值為7.5-8.2,更優選 為 8.0〇
[0041 ]在上述方法中，優選地，在步驟a中，以R2A培養基的體積計，所述R2A培養基的原料 組成包括0.2-1. Og/L酵母粉、0.2-1. Og/L胰蛋白胨、0.2-1. Og/L酪蛋白氨基酸、0.2-1. Og/L 葡萄糖、0.2-1.0g/L可溶性淀粉、0.2-1.0g/L磷酸氫二鉀、0.02-0.06g/L七水硫酸鎂和0. ΙΟ. 5g/L 丙酮酸鈉; 更優選地 ，以 R2A 培養基的體積計 ，所述 R2A 培養基的原料組成包括 0. 5g/L 酵母粉、〇. 5g/L胰蛋白胨、0.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g/L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L 磷酸氫二鉀、〇. 〇5g/L七水硫酸鎂和0.3g/L丙酮酸鈉。
[0042] 在上述方法中，優選地，在步驟a中，所述R2A培養基的pH值為6.8-7.2，更優選為 7.0〇
[0043] 在上述方法中，優選地，該方法包括：
[0044] (1)制備改性沸石
[0045] 將天然沸石置于馬弗爐中，于200-300°C下灼燒1.5-2h;
[0046]按照沸石與HN〇3水溶液的用量之比為1 g: 1 OmL的比例，將灼燒后的沸石置于濃度 為0.01-0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡12-24h，進行酸改性，酸改性結束后，采用去離子水 將沸石沖洗至表面為中性，并將所述沸石在105°C下烘干；
[0047]按照沸石與十六烷基三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g:25mL的比例，將烘干 后的沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水溶液中，于20-30°C下搖床反應 12-24h，進行有機改性，有機改性結束后，采用去離子水對所述沸石進行沖洗以去除其表面 的十六烷基三甲基溴化銨，然后將所述沸石在l〇5°C下烘干，得到改性沸石；
[0048] (2)制備固定化菌劑
[0049] 將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A培養基中進行 活化培養，得到菌液；
[0050] 將菌液接種到固定化培養基中，并向其中加入改性沸石;其中，所述菌液中菌體的 菌齡為70-80h，所述固定化培養基的體積為50mL，所述菌液的接種體積為固定化培養基體 積的3-5%，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g;
[0051] 然后將所述固定化培養基置于轉速為120-180rpm的搖床中進行固定化培養，得到 液態的固定化菌劑;其中，固定化溫度為28-35°C，固定化時間為70-80h。
[0052] 在上述方法中，優選地，該方法還包括對液態的固定化菌劑進行真空冷凍干燥的 步驟。
[0053] 本發明還提供的固定化菌劑能夠用于修復重油溢油污染，特別是能夠用于修復重 油溢油污染潮間帶。所述重油是原油提取汽油、柴油后的剩余重質油，其特點是分子量大、 黏度高;所述潮間帶是指大潮期的最高潮位和大潮期的最低潮位間的海岸，也就是海水漲 至最高時所淹沒的地方開始至潮水退到最低時露出水面的范圍；一旦潮間帶出現重油溢油 污染，石油烴污染物會長期滯留在海岸線環境中，危害海洋生態環境和人體健康。
[0054]本發明的有益效果：
[0055]本發明提供的技術方案將改性沸石最為載體用于菌劑的固定化，一方面提高了菌 劑的機械強度和微生物的活性劑降解效率;另一方面由于其原料來源廣泛，價格低廉，大幅 降低了制備成本；
[0056] 本發明提供的技術方案操作簡單方便，制備成本低，反應條件溫和，最終制得的固 定化菌劑具有較高的微生物活性和細胞容量，對石油烴的降解效率可達40.36%;
[0057] 本發明提供的固定化菌劑在用于修復重油污染潮間帶時，具有菌體不易流失、反 應啟動速率快、與土著菌種競爭處于優勢、環境耐性好等優點，克服了傳統生物修復在實際 應用中存在的一系列不足;該固定化菌劑中的固定化材料(改性沸石)能夠加大潮間帶環境 中土壤的孔隙度，從而加強了氧氣的傳質速率，提高石油污染物的修復速率。
【附圖說明】
[0058]圖1為實施例3提供的固定化菌劑的制備工藝流程圖；
[0059]圖2為實施例2提供的天然沸石改性前后的表面結構對比圖，其中，A圖為天然沸石 改性前的表面結構圖，B圖為天然沸石改性后的表面結構圖；
[0060] 圖3為實施例3提供的固定化菌劑的表面結構圖，其中，A圖為固定化菌劑的形態 圖，B圖為菌劑在沸石表面吸附的形態圖；
[0061] 圖4為實施例3提供的固定化菌劑與其它物質的重油降解性能效果對比圖。
[0062]用于專利程序的微生物保存：
[0063] 迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2;
[0064] 保藏日期：2016年04月08日；
[0065]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);
[0066] 保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；
[0067] 保藏編號：CGMCC No.12333;
[0068] 分類命名：Dietzia cercidiphylli。
【具體實施方式】
[0069] 為了對本發明的技術特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現對本發明的技 術方案進行以下詳細說明，但不能理解為對本發明的可實施范圍的限定。
[0070] 實施例1
[0071 ] 本實施例提供了一種迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的篩選 方法，其是以重質原油為單一碳源，從重油污染潮間帶中篩選得到的，篩選過程如下所述： [0072] 取2g重油污染土壤于100mL已滅菌的R2A培養基中，于25°C_30°C、140rpm、避光條 件下搖床富集培養5d;
[0073] 連續兩次富集處理后，取第2次轉接后的培養液按照10、102、103、104、10 5及106倍進 行梯度稀釋，并取103、104、10 5倍稀釋液分別涂布于含lg/L重油的固體海水培養基，于28°C 培養箱中倒置培養5d-7d;
[0074] 根據平板上不同微生物的菌落形態，用接種環分別挑取出來并劃線至固體R2A培 養基平板，繼續于28 °C倒置培養，重復劃線2-3次，即得到迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2;其中，
[0075] 以R2A培養基的體積計，所述R2A培養基的原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5gAJ夷 蛋白胨、0.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g/L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L磷酸氫二鉀、 0.05g/L七水硫酸鎂、0.3g/L丙酮酸鈉，pH值為7.0;
[0076]所述海水培養基的制備過程包括:將1 .OmL磷酸鹽緩沖溶液、3 .OmL MgS〇4水溶液 (濃度為22 · 5g/L)、1 · OmL CaCl2水溶液（濃度為36 · 4g/L)、1 · OmL FeCl3水溶液（濃度為 0.25g/L)、1. OmL微量元素溶液，定容至1L，調節pH值為7.4，即得到海水培養基;其中，
[0077] 上述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，其原料組成包括8.79g/L的KH2P〇4，21.759g/L 的K2HPO4 · H20,33.48g/L的Na2HP〇4 · 12H20,5.09g/L的NH4CI。
[0078] 上述微量元素溶液的原料組成包括O.lg/L的⑶Cl2 · 6H20,0.425g/L的Μη02 · 4H20,0.05g/L的ZnCl2,0.01g/L的NiCl2 · 6H20,0.015g/L的CuS〇4 · 5H20,0.01g/L的 Na2Mo〇4 · 2H20,以及O.Olg/L的Na2Se〇4 · 2H20。
[0079] 上述迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2主要生理生化特征如 下：迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的菌落呈球形凸起，橙紅色不透 明，表面光滑，菌落呈圓形，邊緣光滑;菌體為直桿狀，無芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性;氧 化酶陰性，接觸氧化酶陽性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽陽性，過氧化氫酶陽性，能氧化乙醇 產酸，能發酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等。該菌種耐鹽性好，在〇%_1〇%的鹽度范圍內均能生 存，鹽度>5%時其生長略受抑制。在模擬海水鹽度下，該菌種10d內對初始濃度為lg/L的委 內瑞拉重油降解效率達20 %以上。
[0080] 實施例2
[0081] 本實施例提供了一種改性沸石的制備方法，其包括以下步驟：
[0082] (1)高溫改性
[0083]在300 °C下對天然沸石(如圖2中的A所示)灼燒2小時，獲得高溫改性沸石；
[0084] (2)酸改性
[0085] 取10g高溫改性沸石置于100mL濃度為0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡24小時，期 間用玻璃棒進行間斷性的攪拌;改性完畢后，用去離子水多次沖洗改性沸石直至為中性，然 后將其置于恒溫干燥箱內于105 °C烘干備用；
[0086] (3)有機改性
[0087] 取8g經高溫改性和酸改性的沸石置于100mL，濃度為12mol/L的十六烷基三甲基溴 化銨的水溶液中，于20-30°C下搖床反應12-24h，進行有機改性;改性完畢后，用去離子水多 次沖洗改性沸石以去除沸石表面的有機改性劑，然后將其置于恒溫干燥箱內于l〇5°C烘干， 制得改性沸石(如圖2中的B所示）。
[0088] 實施例3
[0089] 本實施例提供了一種固定化菌劑的制備方法，其工藝流程如圖1所示，該方法包括 以下步驟：
[0090] 1)固定化條件的確定
[0091] 通過單因素實驗對菌劑的固定化條件進行考察，實驗設計如表1所示。
[0092] 表1吸附固定條件單因素設計表
[0094] 表2 Plackeet-Burman實驗設計及結果
[0096]按照表1的設計進行單因素實驗，最終的實驗結果表明，當油去除率達到最高值 時，菌劑對應的吸附固定條件為:吸附固定溫度為35°C、吸附固定的時間為72h、pH值為8、鹽 度為1.5%、吸附固定的轉速為180rpm、載體的投加量為2g、菌齡為72h。
[0097] 上述實驗確定了單個環境條件對固定化菌劑性能的影響，然而，在實際過程中，環 境條件之間是相互影響的。因而，必須在單因素的基礎上考慮復合因素對菌劑固定化的影 響。
[0098] 本發明采用響應面法研究多因子系統中因子交互作用達到最大響應值時所對應 的最佳條件。
[0099] 表3 Plackeet-Burman因素水平及主效應分析
[0101 ] 采用N= 12的Plackeet-Burman實驗設計，針對吸附固定條件中7個原油去除率較 高的單因素進行研究，每個因素取"+Γ和"-Γ兩個水平，"+Γ水平取"-Γ水平的1.25倍，響 應值為原油的周去除率。
[0102] Plackeet-Burman試驗設計及結果分析見表2,試驗各因素主效應分析的結果見表 3〇
[0103] 根據P值，在95%的置信區間上，即P〈0.05時，因素顯著，即吸附固定的時間、載體 的投加量和菌齡對菌劑的固定化效果影響最為顯著，且吸附固定的時間和菌齡有顯著正效 應，應增加;載體的投加量有顯著負效應，應減少。
[0104] 根據Plackett-Burman實驗分析的結果確定下一步實驗的最陡爬坡路徑。由表3可 知，吸附固定的時間和菌齡有顯著正效應，應增加;載體的投加量有顯著負效應，應減少。負 效應因素固定在-1水平;正效應因素固定在+1水平。根據這兩個因素效應大小的比例設定 它們的變化方向以及步長，試驗設計及結果見表4。
[0105]表4最陡爬坡試驗設計及結果
[0107]通過表4的實驗結果可知，隨著吸附固定的時間和菌齡的逐漸增大。載體的投加量 的逐漸減小，原油去除率呈現先增加后降低的變化。當吸附固定的時間為75h，菌齡為 75.5h，載體的投加量為1.7g時，原油去除率(40.56%)最大，為三個因子的最大響應值區 域。故本發明以實驗的各因素水平為中心點進行后續響應面實驗分析。
[0108] 本發明最終采用Box-Bchnken中心組合實驗設計和響應面分析方法確定最優吸附 固定條件分別為:吸附固定的時間75h，菌齡75.6h，載體的投加量1.7g，此時對應的最大原 油去除率為42.56%。
[0109]因此，本發明確定最優的固定化條件為:接種5 %的菌齡為75.6h的菌體于50mL的 固定化培養基中（注：固定化培養基的pH值為8.0，其原料組成包括5g/L牛肉膏，10g/L NaCl，以及10g/L蛋白胨），添加1.7g改性沸石，在35°C，180rpm的搖床中震蕩培養75h。在該 最優化條件下，對固定化菌劑的重油降解效果進行驗證性試驗，試驗測得原油降解效率為 40.36%〇
[0110] 2)菌液的制備
[0111] 菌種為石油經降解菌迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2,菌種 保藏編號為:CGMCC No. 12333。將上述菌種接種在100mL的R2A培養基中，30°C，180rpm/min 震蕩培養75.6h，待用;其中，
[0112]上述R2A培養基的pH值為7.0，其原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5gAJ夷蛋白胨、 〇.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g//L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L磷酸氫二鉀、0.05g/L七水 硫酸鎂，以及〇. 3g/L丙酮酸鈉。
[0113] 3)固定化菌劑的制備
[0114] 表5固定化菌劑的物理特性
[0115]
[0116] 按5%的接種量將上述菌液接種到50mL的固定化培養基中，添加1.7g實施例2提供 的改性沸石，在35°C，180rpm的搖床中震蕩培養75h，即得液態的固定化菌劑;將獲得的液態 固定化菌劑進行真空冷凍干燥，即得固態的固定化菌劑(如圖3所示），該固態的固定化菌劑 的物理特性如表5所示，表5中固定化菌劑的機械性能很好，表明固定化菌劑適用于海洋環 境的沖刷。
[0117] 實施例4
[0118] 本實施例對上述實施例3提供的固定化菌劑的重油降解性能進行了測試，測試使 用的模擬實驗裝置由主裝置系統、造波系統、海岸帶系統及控制系統等組成。
[0119] 以委內瑞拉重油為污染物，在模擬海水鹽度下考察上述固定化菌劑的石油降解性 能，實驗步驟如下所述：
[0120] 1)將2.5g實施例3提供的固定化菌劑接種于100mL模擬石油污染的海水培養基中， 重油含量為lg/L，在25°030 <€、180印111、避光條件下振蕩培養7(1，測定固定化菌劑的原油降 解效率。每個實驗設置3個平行，分別記錄3次的操作結果，取平均值；
[0121] 2)將與上述步驟（1)中2.5g固定化菌體中細菌的濕重相同重量的游離菌體(該游 離菌體為實施例1提供的迪茨氏桿菌)添加于100mL模擬石油污染的海水培養基中，委內瑞 拉重油含量為lg/L，在25°030°(：、180印 111、避光條件下振蕩培養7(1，作為對照例，測定游離 菌體的原油降解效率。每個實驗設置3個平行，分別記錄3次的操作結果，取平均值；
[0122] 3)將與步驟(2)中游離菌體相同重量的無菌蒸餾水添加于lOOmL模擬石油污染的 海水培養基中，委內瑞拉重油含量為lg/L，在25°C_30°C、180rpm、避光條件下振蕩培養7d， 作為陰性對照例，實驗設置3個平行；
[0123] 降解7d后，上述步驟（1)、（2)、（3)中海水培養基中剩余原油的含量經四氯化碳萃 取、定容后，采用紅外測油儀進行測定，降解率（％ ) = 1〇〇Χ(對照培養液中殘余油含量-實 驗培養液中殘余油含量)/對照培養液中殘余油含量
[0124] 上述重油為委內瑞拉稠油，20°C的密度為0.9593g/cm3,50°C的運動粘度為 228.lmm 2/s〇
[0125] 上述海水培養基的制備過程包括:將1 .OmL磷酸鹽緩沖液、3.0mL MgS〇4水溶液(濃 度為22 · 5g/L)、1 · OmL CaClwK溶液(濃度為36 · 4g/L)、1 · OmL FeCl3水溶液(濃度為0 · 25g/ L)、以及1. OmL微量元素溶液，定容至1L，調節pH值為7.4;其中，
[0126] 上述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，其原料組成包括8.5g/L的KH2P〇4，21.75g/L的 K2HPO4 · H20,33.4g/L的Na2HP〇4 · 12H20,以及5.0g/L的NH4C1;
[0127] 上述微量元素溶液的pH值為7.0,其原料組成包括39.9mg/L的MnS〇4 · H20,42.8mg/ L的ZnS〇4 · H2O,以及34.7mg/L的（NH4)6M〇7〇2 · 4H20。
[0128] 石油降解效率的測試對比結果(如圖4所示)表明，降解7d后，實施例3提供的固定 化菌劑的石油降解效率可達到40.36 %，相比對照例游離菌的石油降解率17.10 %提高了 2.36倍，相比陰性對照例（其自然損失率為5.91%)則提高了近6.8倍，圖4中的"改性沸石" 即為實施例2提供的改性沸石。
[0129] 綜上所述，從本發明提供的固定化菌劑的機械性能、傳質效率、制備成本、制備工 藝及原油降解效率發明綜合考慮，該固定化菌劑可有效作用于溢油污染潮間帶的生物修 復，具有廣闊的應用前景。
【主權項】
1. 一種固定化菌劑的制備方法，其包括以下步驟 a、 菌體的活化:將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A培養 基中進行活化培養，得到菌液； b、 菌體的固定化:將上述菌液接種到固定化培養基中，并向其中加入改性沸石，然后將 固定化培養基置于搖床中，在預定的固定化溫度和固定化時間下進行培養，得到液態的固 定化菌劑。2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽 區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所;保藏日期為2016年4月8日，保藏編號為 CGMCC No.12333。3. 根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟b中，所述改性沸石的制備方法包括以下步 驟： 步驟一、將天然沸石在200-300 °C下灼燒1.5-2h; 步驟二、將經步驟一處理后的沸石置于濃度為0.01-0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡12-24h，進行酸改性;其中，所述沸石與所述HN03水溶液的用量之比為lg:10mL; 步驟三、將經步驟二處理后的沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水 溶液中，于20_30°C下搖床反應12-24h，進行有機改性，得到改性沸石;其中，所述沸石與所 述十六烷基三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g: 25mL; 優選地，在步驟二中，酸改性結束后，該方法還包括采用去離子水將所述沸石沖洗至表 面為中性，并將所述沸石烘干的步驟； 更優選地，在步驟三中，有機改性結束后，該方法還包括采用去離子水對所述沸石進行 沖洗以去除其表面的十六烷基三甲基溴化銨，并將所述沸石烘干的步驟。4. 根據權利要求1-3任一項所述的方法，其中，在步驟b中，菌體的固定化參數為： 所述菌液中菌體的菌齡為70-80h，所述固定化培養基的體積為50mL，所述菌液的接種 體積為固定化培養基體積的3-5 %，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g; 所述搖床的轉速為120-180rpm，所述固定化溫度為28-35°C，所述固定化時間為70-80h〇5. 根據權利要求4所述的方法，其中，在步驟b中，菌體的固定化參數為： 所述菌液中菌體的菌齡為75.6h; 優選地，所述菌液的接種體積為固定化培養基體積的5% ; 更優選地，所述改性沸石的添加量為1.7g; 進一步優選地，所述固定化時間為75h。6. 根據權利要求1-5任一項所述的方法，其中，在步驟b中，以固定化培養基的體積計， 所述固定化培養基的原料組成包括3_8g/L牛肉膏、5-15g/L NaCl和5-15g/L蛋白胨； 優選地，以固定化培養基的體積計，所述固定化培養基的原料組成包括5g/L牛肉膏、 10g/L NaCl和 10g/L蛋白胨； 更優選地，所述固定化培養基的pH值為7.5-8.2; 進一步優選地，所述固定化培養基的pH值為8.0。7. 根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟a中，以R2A培養基的體積計，所述R2A培養 基的原料組成包括Ο . 2-1. Og/L酵母粉、0.2-1. OgAJ夷蛋白胨、Ο . 2-1. OgAJI蛋白氨基酸、 0.2-1. Og/L 葡萄糖、0.2-1. Og/L 可溶性淀粉、0.2-1. Og/L 磷酸氫二鉀、0.02-0.06g/L 七水硫 酸鎂和0.1-0.5g/L丙酮酸鈉； 優選地，以R2A培養基的體積計，所述R2A培養基的原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5g/L 胰蛋白胨、〇.5gAJ|蛋白氨基酸、0.5g//L葡萄糖、0.5g//L可溶性淀粉、0.3gAJ粦酸氫二鉀、 0.05g/L七水硫酸鎂和0.3g/L丙酮酸鈉； 更優選地，所述R2A培養基的pH值為6.8-7.2; 進一步優選地，所述R2A培養基的pH值為7.0。8. 根據權利要求1所述的方法，其中，該方法包括： 制備改性沸石： 將天然沸石置于馬弗爐中，于200-300°C下灼燒1.5-2h; 按照沸石與HN〇3水溶液的用量之比為lg:10mL的比例，將灼燒后的沸石置于濃度為 0.01-0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡12-24h，進行酸改性，酸改性結束后，采用去離子水將 沸石沖洗至表面為中性，并將所述沸石在l〇5°C下烘干； 按照沸石與十六烷基三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g:25mL的比例，將烘干后的 沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水溶液中，于20-30°C下搖床反應12-24h，進行有機改性，有機改性結束后，采用去離子水對所述沸石進行沖洗以去除其表面的 十六烷基三甲基溴化銨，然后將所述沸石在105°C下烘干，得到改性沸石； 制備固定化菌劑： 將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A培養基中進行活化 培養，得到菌液； 將菌液接種到固定化培養基中，并向其中加入改性沸石;其中，所述菌液中菌體的菌齡 為70-80h，所述固定化培養基的體積為50mL，所述菌液的接種體積為固定化培養基體積的 3-5%，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g; 然后將所述固定化培養基置于轉速為120-180rpm的搖床中進行固定化培養，得到液態 的固定化菌劑;其中，固定化溫度為28-35°C，固定化時間為70-80h。9. 根據權利要求1所述的方法，其中，該方法還包括對液態的固定化菌劑進行真空冷凍 干燥的步驟。10. -種用于固定化菌劑，其是由權利要求1-9任一項所述的制備方法制得的。11. 權利要求10所述的固定化菌劑在修復重油溢油污染上的應用； 優選地，所述固定化菌劑在修復重油溢油污染潮間帶上的應用。12. 保藏編號為CGMCC No.12333的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX- 2〇
【文檔編號】C02F101/32GK105936901SQ201610438176
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】宋佳宇, 閻光緒, 代小麗, 劉思敏, 王凌勻
【申請人】中國石油天然氣股份有限公司