基于CRISPR/Cas9和釀酒酵母細胞內源的同源重組的分子克隆方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新的分子克隆方法，具體而言，涉及通過組合利用CRISPR/Cas9 系統和釀酒酵母細胞內源的同源重組系統對初始載體進行改造，以獲得重組載體的方法， 所述方法僅通過一次轉化篩選操作，即可同時完成將一個或多個目的DNA片段插入初始載 體、從初始載體上刪除一個或多個DNA片段和/或將載體上的一個或多個DNA片段替換為 一個或多個目的DNA片段。本發明還涉及用于方便有效地實施本發明所述的分子克隆方法 的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 分子克隆是將目的DNA片段與載體DNA組裝為重組載體后導入宿主細胞或生物 體，使其在宿主內復制的分子生物學實驗方法。在宿主細胞擴增過程中，帶有目的DNA片段 的重組載體能夠作為宿主基因組的一部分或者獨立地復制，從而被后代細胞繼承。通過這 樣的方式，能夠獲得帶有所述目的DNA片段的細胞群體，從而實現從單個目的DNA片段獲得 大量完全相同的目的DNA片段。這一過程即克隆過程。其中，所述目的DNA可來源于對宿 主而言為同源或異源的生物體，或者為人工序列。分子克隆技術作為現代生物學的核心技 術，被廣泛地用于測序、遺傳工程、蛋白純化、生物制藥等各方面。
[0003] 在傳統的分子克隆技術中，一般利用"酶切-連接"的方式將目的DNA與載體進行 連接：首先通過限制性酶切在目的DNA和載體DNA上制造互補的黏性末端或者平末端，再用 連接酶將二者連在一起，生成帶有目的DNA的載體，也稱為重組載體（Nathans D.等，1975， Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules， Annu. Rev. Biochem. 44 :273 - 93)。限制性內切酶特異性地識別靶DNA序列（即酶切位點）。 因此，為了能夠對多個目的DNA片段進行操作，常用的工程化及商業化的載體通常具有多 克隆位點，且針對目的DNA片段的操作（例如插入、替換和/或刪除）大多在多克隆位點處 進行。在實踐中，對目的DNA的每次操作都需要進行一系列的酶切連接、轉化和篩選步驟， 該過程需要數天時間。此外，常常發生需要操作的位置沒有酶切位點、或希望使用的限制性 內切酶在載體或目的片段上存在多個靶點的情況，此時需要更多的時間和更繁瑣的步驟對 載體進行改造。當需要將多個片段連入載體時，傳統的分子克隆技術費時耗力且成本極高。
[0004] 作為改進，基于酶切-連接的Biobrick方法利用同尾酶實現片段的逐級組裝 (Sleight S.C.等，In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering. Nucleic Acids Res，2010,38(8) :2624-36)。該方法僅使用4個限制性內切酶EcoRI、XbaI、SpeI以及PstI 即可完成任意數量片段的組裝，省去了挑選合適的限制性內切酶的復雜過程。然而，每操 作一個片段仍需要進行一系列的酶切連接、轉化和克隆篩選。該方法不能同時實現多個片 段的拼接。目前最有效的DNA操作方法為Gibson拼接（Gibson Assembly)。該方法的原 理在于，將20~80bp的短重疊序列添加至各待連接的片段（例如需要首尾相連的多個 DNA片段）的末端，重疊序列的設置用于保證各片段的組裝順序。在50°C的孵育溫度下， Gibson拼接混合物中的DNA外切酶從5'端降解部分核苷酸產生黏性末端，從而待拼接的兩 相鄰片段的重疊區之間可以通過退火而互補，然后在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下將 缺口補齊，形成完整的雙鏈DNA，實現無痕拼接（Gibson, D.G.等，Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods 6,343-345,2009)〇 Gibson拼接技術不區分載體片段和目的片段，其優勢在于簡便快速、能直接使用PCR片段、 不需要回收步驟、且可以處理多個片段。然而，傳統的Gibson拼接方法對片段大小要求嚴 格。例如，小于l〇〇bp的片段不能正確拼接。另外，當片段數增多時，正確拼接效率下降。
[0005] 最近報道了組合利用CRISPR/Cas9系統和Gibson拼接的體外克隆方法。以色列 專利申請62043公開了一種大基因簇釣取方法（CATCH)，該方法包含如下步驟：將細菌包埋 到瓊脂塊中，經過溶菌酶、蛋白酶K處理后，將所述瓊脂塊與包含Cas9蛋白、預先設計的針 對抓取位點的sgRNA對及緩沖液混合，孵育2小時，使得瓊脂塊中酶充分擴散且基因組DNA 被充分酶切；通過脈沖場電泳分離目的片段并純化，隨后利用Gibson拼接，將被釣取的大 片段DNA連入BAC載體。類似地，Jia-Wang Wang等提出了組合利用CRISPR/Cas9核酸酶 酶切與Gibson拼接的無縫克隆方法。該方法首先利用CRISPR/Cas9將載體線性化，隨后在 Gibson拼接系統中將線性化的載體與一個編碼青色熒光蛋白的DNA片段（853bp)孵育，獲 得Gibson拼接產物。將Gibson拼接產物轉化入大腸桿菌，并篩選陽性克隆（Wang J-W.等， 2015， CRISPR/Cas9nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning，BioTechniques 58:161-170. doi 10. 2144/000114261)。然而，這些方法并未提及 是否可同時對多個目的片段進行操作，也未考慮多片段拼接的效率問題。
[0006] 目前，本領域還未提出利用CRISPR/Cas9系統作為分子生物學工具，針對載體上 的多個靶點或針對多個目的DNA片段進行操作的體外分子克隆方法。
【發明內容】
[0007] -方面，本發明提供了一種分子克隆方法，所述方法通過將一個或多個目的DNA 片段插入初始載體、從初始載體上刪除一個或多個DNA片段和/或將所述初始載體上的一 個或多個DNA片段替換為目的DNA片段，獲得重組載體，所述方法包含如下步驟：
[0008] (1)定位：針對初始載體上待實施插入、刪除和/或替換的的各個位點，設計并通 過體外轉錄合成單導向RNA (single-guide RNA，sgRNA);
[0009] (2)酶切：在體外利用Cas9核酸酶和步驟（1)獲得的sgRNA對所述初始載體進行 酶切，使得所述待實施插入、刪除和/或替換的各個位點處的DNA雙鏈斷裂，對酶切后的各 初始載體片段進行回收和純化；
[0010] (3)制備同源臂序列：針對待連接的各相鄰片段，制備用于釀酒酵母同源重組的 同源臂序列，所述同源臂序列位于第一待連接片段和/或第二待連接片段的側翼，或者所 述同源臂序列以同源臂片段的形式單獨存在；
[0011] (4)連接和轉化：將步驟⑶制備的所述同源臂序列、步驟⑵獲得的所述初始載 體片段以及任選的所述目的DNA片段轉化入釀酒酵母細胞；
[0012] (5)篩選和獲得重組載體：篩選出帶有所述重組載體的釀酒酵母細胞陽性克隆， 從而獲得帶有重組載體的釀酒酵母細胞，
[0013] 其中，所述重組載體為能夠在所述釀酒酵母細胞中復制的載體。
[0014] 另一方面，本發明還提供了用于方便有效地實施本發明所述的分子克隆方法的試 劑盒，所述試劑盒包含獨立包裝的sgRNA克隆載體、Cas9核酸酶以及釀酒酵母細胞。
[0015] 有益效果
[0016] 本發明的方法組合利用CRISPR/Cas9和釀酒酵母內源的同源重組系統替代傳統 的"酶切"和"連接"，僅通過一次轉化篩選，即可在初始載體的任意位置實現將一個或多個 目的DNA片段插入初始載體、從初始載體上刪除一個或多個DNA片段和/或將載體上的一 個或多個DNA片段替換為一個或多個目的DNA片段。特別地，針對某一待實施插入的位點 而言，可同時插入一個或多個目的DNA片段。這是第一次在體外實現同時針對多個位點、對 多個DNA片段進行多種操作的一步克隆方法。
[0017] 具體而言，Cas9核酸酶的作用位點完全取決于所設計的sgRNA序列。由于sgRNA 通常為約20bp，遠大于限制性內切酶所識別的6-8bp的序列，因此特異性大大提高。并且， 由于可針對任意的DNA序列設計所匹配的sgRNA，因此能夠針對載體的任何位點實施操作。 利用CRISPR/Cas9使得初始載體的一個或多個位點發生雙鏈斷裂便于對初始載體進行片 段化處理，從而在隨后的同源重組過程中，能夠在同源臂序列的指引下，將一個或多個載體 片段與任選的目的片段按順序拼接。通過這樣的方式，能夠同時針對多個待操作位點實施 插入、刪除和/或替換。
[0018] 另一方面，本發明利用釀酒酵母內源的高效的同源重組系統，使得多片段的連接 和轉化同時完成。其中，同源臂可位于第一待連接片段和/或第二待連接片段側翼，或者以 同源臂片段（寡核苷酸片段）的形式單獨存在，無論待連接片段來自于PCR產物、酶切產物 還是人工合成序列，以如上任一種方式設置的同源臂都能保證各待連接片段的順序連接， 從而方便地實施連接和轉化操作。由于本發明方法中的連接和轉化步驟利用釀酒酵母細胞 內源的同源重組系統，要求重組載體帶有釀酒酵母的復制起始位點，以允許重組載體在酵 母細胞內復制。然而，重組載體也可帶有允許在其它宿主內復制的其它復制起始位點。在 這種情況下，所構建的重組載體為能夠在兩種以上宿主中復制的穿梭質粒。通過這樣的方 式，本發明的方法可用于構建針對更寬的宿主范圍的載體。
[0019] 特別地，在優選實施方式中，待實施插入、刪除和/或替換的一個或多個DNA片段 可以編碼與抗生素抗性、營養缺陷篩選和/或宿主特異性復制起始位點相關的基因。從而 與初始載體相比，重組載體的抗性、營養缺陷性質和/或允許其復制的宿主發生改變。例 如，通過將初始載體上的一種抗生素抗性或營養缺陷篩選相關基因替換為另一抗生素抗性 或營養缺陷篩選相關基因，能夠顯著提高本發明方法的陽性率。
【附圖說明】
[0020] 圖1為根據本發明方法的步驟（3)中同源臂序列設置的示意圖。對于一個待操作 位點而言，同源臂序列可以位于待連接片段中其中一個的側翼（a)、位于各待連接的片段的 側翼（b)或者以同源臂片段的形式單獨存在（c)。
[0021] 圖2為本發明實施例中使用的初始載體pHY-wt的質粒圖譜。
[0022] 圖3為根據本發明實施例1-12,對初始載體的多個靶點進行如下操作的示意圖 (為方便描述，以編號I-V表示待操作的各位點，以編號1-9表示各片段）：將位點I和位 點II之間的ura3替換為trpl，在位點III、IV和V處分別插入片段7(lacZ片段）、片段 8 (mRFP片段）以及片段9 (Apr片段）。
[0023] 圖4為對本發明實施例1-3獲得的克隆進行菌落PCR后利用瓊脂糖凝膠電泳進行 分析的結果。Μ為DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道為利用表3所 示的引物，對隨機挑選的20個克隆進行菌落PCR后瓊脂糖凝膠電泳的結果。
[0024] 圖5為對本發明實施例4-6獲得的克隆進行菌落PCR后利用瓊脂糖凝膠電泳進行 分析的結果。Μ為DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道為利用表3所 示的引物，對隨機挑選的20個克隆進行菌落PCR后瓊脂糖凝膠電泳的結果。
[0025] 圖6為對本發明實施例7-9獲得的克隆進行菌落PCR后利用瓊脂糖凝膠電泳進行 分析的結果。Μ為DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道為利用表3所 示的引物，對隨機挑選的20個克隆進行菌落PCR后瓊脂糖凝膠電泳的結果。
[0026] 圖7為對本發明實施例10-12獲得的克隆進行菌落PCR后利用瓊脂糖凝膠電泳進 行分析的結果。Μ為DL2000plus DNA marker(TransGen Biotech)，其它各泳道為利用表3 所示的引物，對隨機挑選的20個克隆進行菌落PCR后瓊脂糖凝膠電泳的結果。
【具體實施方式】 [0027] 分子克隆方法
[0028] 如上所述，本發明的方法組合利用了 CRISPR/Cas9和釀酒酵母內源的同源重組系 統，首先在體外利用sgRNA導向的Cas9核酸酶在初始載體的待實施插入、刪除和/或替換 的一個或多個位點制造雙鏈斷裂，將全部片段純化回收，獲得初始載體各片段；隨后將獲得 的初始載體片段、同源臂序列和任選的目的DNA片段共同轉化入釀酒酵母，利用釀酒酵母 自身的同源重組系統將各片段順序連接，在理想情況下，轉化子含有各片段均按順序連接 的重組載體；最后篩選帶有重組載體的陽性克隆。利用本發明的方法，能夠僅通過一步轉化 篩選操作，將一個或多個目的DNA片段插入初始載體、從初始載體上刪除一個或多個DNA片 段和/或將載體上的一個或多個DNA片段替換為一個或多個目的DNA片段。所述一個或多 個目的DNA片段可以是例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個以上DNA 片段，所述待實施插入、刪除和/或替換的位點可以是例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、 7個、8個、9個或10個以上位點。在一些實施方式中，能夠僅通過一步轉化篩選操作，將一 個或多個（例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個以上）目的DNA片 段插入初始載體的一個或多個（例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10 個以上）位點；將初始載體上一個或多個（例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、 9個或10個以上）位置的片段替換為一個或多個（例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7 個、8個、9個或10個以上）目的DNA片段；和/或將初始載體上一個或多個（例如1個、2 個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個以上）位置的一個或多個（例如1個、2個、 3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個以上）待實施刪除的片段刪除。由于本發明的 方法對初始載體同樣采取片段化處理，針對某一插入或替換位點而言，待插入或待替換的 目的DNA片段數量沒有特別的限制。在一些實施方式中，可將一個以上（例如1個、2個、3 個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個以上）目的DNA片段插入同一待插入位點。在一 些實施方式中，可用一個以上（例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個 以上）目的DNA片段替換初始載體上的一個（被替換）片段。
[0029] 本發明中使用的術語"初始載體"是指實施目的片段的插入、替換和/或刪除前 的載體。初始載體可為環狀質粒或線狀載體，例如但不限于宿主特異性質粒、穿梭質粒、 細菌人工染色體（BAC)或酵母人工染色體（YAC)。初始載體也可為克隆載體或表達載 體。作為宿主特異性質粒，初始載體可為僅能在大腸桿菌（Escherichia coli)、鏈霉菌 (Streptomyces)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)、真菌（fungi)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母 (S. pombe)、畢赤酵母（Pichia membranaefaciens)、哺乳動物細胞（mammalian cells)中復 制的質粒。或者，初始載體可為穿梭質粒，例如大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒、大腸桿菌-鏈 霉菌穿梭質粒、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒、大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌穿梭質粒、 細菌-哺乳動物細胞穿梭質粒、細菌-植物細胞穿梭質粒、大腸桿菌-絲狀真菌穿梭質粒、 大腸桿菌-鏈霉菌-釀酒酵母穿梭質粒、大腸桿菌-絲狀真菌-釀酒酵母穿梭質粒、大腸桿 菌-枯草芽孢桿菌-釀酒酵母穿梭質粒、大腸桿菌-谷氨酸棒狀桿菌-釀酒酵母穿梭質粒、 細菌-哺乳動物-釀酒酵母細胞穿梭質粒或細菌-植物細胞-釀酒酵母穿梭質粒。所述絲 狀真菌例如但不限于黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、黃曲霉 (Aspergillus flavus)。在初始載體不能在釀酒酵母中復制的實施方式中，待實施插入和 /或替換的目的片段包含釀酒酵母源復制起始位點。可在兩種以上物種中復制的穿梭質粒 或穿梭載體為本領域技術人