一種褐藻膠裂解酶Algb及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設計一種褐藻膠裂解酶基因 algb。本發明還提供了含有該基因的載體和大 腸桿菌重組菌株及其表達產物的生產方法和應用。
【背景技術】
[0002] 褐藻膠是由ct -L-古羅糖醛酸（G)和β -D-甘露糖醛酸（M)兩種單糖醛酸組成的 線型酸性多糖，廣泛地存在于海帶、裙帶菜等大型褐藻類植物細胞壁中。隨著糖生物學與糖 化學研究的逐步深入，許多海洋寡糖，尤其是褐藻膠的降解產物-褐藻膠寡糖具有多種生 物學活性。例如，低聚合度的褐藻膠寡糖具有降血脂、抗病毒、抗腫瘤以及抗氧化等生物學 活性，有的已經開發為藥品。以褐藻膠為原料制備褐藻膠寡糖有多種方法：酸解法、氧化降 解法、超聲降解法和酶降解法。
[0003] 其中，酸解法和氧化降解法降解條件難以控制，操作較為復雜，耗時長。超聲降解 法一般與其他降解法共同使用，降解產物聚合度高，不易制得寡糖；酶法降解相對于其他降 解方法具有降解條件溫和，反應條件易于控制，產物特異性強，得率高等優點，因此成為制 備褐藻膠寡糖的首選方法。
[0004] 制備褐藻膠寡糖所使用的酶即褐藻膠裂解酶，屬于多糖裂解酶家族成員，能夠催 化糖醛酸單元之間的1，4糖苷鍵發生水解，在斷裂后新形成的非還原端生成雙鍵。按照其 底物特異性的差異，褐藻膠裂解酶可以分為三類：專一性降解聚甘露糖醛酸的聚甘露糖醛 酸裂解酶（EC4. 2. 2. 3)、專一性降解聚古羅糖醛酸的聚古羅糖醛酸裂解酶（EC4. 2. 2. 11)和 能降解上述兩種片段的雙功能褐藻膠裂解酶。由于其具有底物專一性，褐藻膠裂解酶主要 用于制備特異性結構的褐藻膠寡糖，研究褐藻膠的化學結構等方面；此外，褐藻膠裂解酶還 可以應用于治療肺囊腫性纖維化，制備海帶等大型褐藻的原生質體等。
[0005] 褐藻膠裂解酶主要來源于海洋動植物（包括海洋軟體動物、海洋藻類）和多 種微生物（包括海洋細菌、土壤細菌和真菌）。根據其底物特異性不同，可分為兩大類： 專一性降解聚甘露糖醛酸的裂解酶（EC4. 2. 2. 3)和專一性降解聚古羅糖醛酸的裂解酶 (EC4. 2. 2. 11);此外還有一些能夠降解上述兩種片段的雙功能裂解酶，主要是來源于交替 假單胞菌勵272(?8611(1〇3]^61'01]101^3 3口.勵272)的褐藻膠裂解酶417;從交替假單胞菌 Pseudoaltermonas sp.SM0524 中分離得到的 AlySJ-〇2 ;從 Isoptericola halotolerans 分 離得到褐藻膠裂解酶以及從麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomsa maltophilia KJ-2)克隆得 到的褐藻膠裂解酶；以上四種裂解酶均具有降解PM和PG的能力，降解產物多為DP2-6的 寡糖。雙功能的褐藻膠裂解酶由于其廣泛的底物特異性而在工業生產上具有重要的應用價 值，主要用于褐藻膠寡糖的生產。本發明所涉及的褐藻膠裂解酶具有降解兩種片段的能力， 并且在廣泛的pH范圍內具有良好的活性與穩定性，具有重要的工業應用價值。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一個目的是提供一種新型褐藻膠裂解酶Algb及其編碼基因。
[0007] 本發明的第二個目的是提供一種制備新型褐藻膠裂解酶Algb的方法。
[0008] 本發明的第三個目的是提供新型褐藻膠裂解酶Algb基因重組表達質粒和重組基 因工程菌株。
[0009] 本發明的第四個目的是提供新型褐藻膠裂解酶Algb在褐藻膠降解中的應用。
[0010] 本發明所提供的褐藻膠裂解酶Algb,來源于弧菌菌株Vibrio alginolyticus 40B，其氨基酸序列具有如下特征之一：
[0011] 1)序列表中的SEQ ID N0. 2從氨基端開始的第1-478位氨基酸殘基序列。
[0012] 2)將序列表中的SEQ ID N0. 2從氨基端開始的第1-478位氨基酸殘基序列經過氨 基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加后具有降解褐藻膠活性的蛋白質。
[0013] 本發明提供了新型褐藻膠裂解酶Algb的編碼基因（命名為algb)，具有下述核苷 酸序列特征之一：
[0014] 1)序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧糖核酸（DNA)序列；
[0015] 2)編碼序列表中SEQ ID NO. 1氨基酸序列的脫氧核糖核酸（DNA)序列；
[0016] 本發明的新型褐藻膠裂解酶Algb的氨基酸序列及其核苷酸編碼序列也可以根據 預測的Algb的氨基酸序列及其核苷酸序列人工合成獲得。
[0017] 制備重組酶Algb的方法，是將編碼基因 algb克隆到重組表達載體，導入宿主細 胞，獲得重組表達的褐藻膠裂解酶。
[0018] 所述的重組表達內切褐藻膠裂解酶Algb的表達載體可以是大腸桿菌表達載體、 酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真 菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體等。
[0019] 用于重組表達褐藻膠裂解酶Algb的重組菌或轉基因細胞系，可以是大腸桿菌宿 主細胞（如 Escherichia coli BL21>Escherichia coli JM109>Escherichia coli DH5 a 等）、酵母菌宿主細胞（如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis 等）、枯草桿菌宿主細胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細胞（如Lactic acid bacteria C0CC101等）、放線菌宿主細胞（如 Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細胞（如 Trichoderma viride，Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細胞（如 Bombyx mori, Antharaea eucalypti等）或哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CH0,幼小倉鼠腎臟細胞 BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等）。
[0020] 本發明的新型褐藻膠裂解酶Algb來源于弧菌菌株Vibrio alginolyticus40B，通 過基因組挖掘技術，分析Vibrio alginolyticus40B基因組中可能的褐藻膠裂解酶基因，依 據同源序列通過設計特異性引物，克隆得到褐藻膠裂解酶Algb全長編碼基因，該基因編碼 區長1437bp，編碼478個氨基酸，分子量約為54. 12kDa，屬于多糖裂解酶家族7。大腸桿菌 表達獲得重組酶Algb，以褐藻膠為底物時，在30°C、ρΗ8· 0條件下具有最高酶活力，比活力 達到 48. 79U/mg。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :新型褐藻膠裂解酶Algb的蛋白質三維結構模型：整體結構為手套狀_β -三 明治結構（glove-like-β-sandwich)，其中包含 3 個小螺旋結構（HI :22-26 ;H2 :76-79 ; H3 :185-189)以及2個反向平行的β-折疊片A和B，A包含8個β-strand結構，B包含7 個β -strand結構。
[0022] 圖2 :新型褐藻膠裂解酶Algb表達及純化的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（SDS-PAGE)。 各泳道加入的樣品分別是：M:蛋白標準分子量（marker)，條帶自上到下順序為：170kDa， 130kDa，110kDa，70kDa，55kDa，40kDa，35kDa，25kDa ;泳道 1 :重組菌體破碎后上清，上樣量 為10 μ 1，泳道2 :重組菌破碎后上清經鎳柱純化的流出液，上樣量10 μ 1 ;泳道3: lOmmol咪 唑洗脫液，上樣量10 μ 1 ;泳道4 :20mmol咪唑洗脫液，上樣量10 μ 1 ;泳道5 :50mmol咪唑洗 脫液，上樣量10 μ 1 ;泳道6 :250mmol咪唑洗脫液，上樣量10 μ 1。
[0023] 圖3 :溫度對于褐藻膠裂解酶Algb活性的影響。
[0024] 圖4 :pH對于褐藻膠裂解酶Algb活性的影響。
[0025] 圖5 :溫度對于褐藻膠裂解酶Algb的穩定性的影響。
[0026] 圖6 :pH對于褐藻膠裂解酶Algb的穩定性的影響。
[0027] 圖7 :褐藻膠裂解酶Algb的底物偏好性曲線。
[0028] 圖8 :褐藻膠裂解酶對于三種底物的降解產物ESI-MS圖譜。A :褐藻膠底物的降解 產物的ESI-MS譜圖，B :polyM底物的降解產物的ESI-MS譜圖，C :polyG底物的降解產物的 ESI-MS 譜圖。
【具體實施方式】
[0029] 實施例lVibrio alginolyticus 40B的培養及菌株基因組DNA提取
[0030] 所采用的菌種為弧菌Vibrio alginolyticus,挑取菌株的單克隆菌落接種到50ml 液體培養基中，接著放入溫度為30°C、轉數為220rpmin的搖床培養24小時后，將培養液離 心收集菌體并丟棄上清培養基。
[0031] 使用的液體培養基配方為（g/L):牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉1. 0g、NaCl 5. 0g