生產四氫葉酸的重組質粒、基因工程菌株構建及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，涉及一種用于生產四氫葉酸的重組質粒和一種高產四 氫葉酸的基因工程菌。本申請還涉及上述重組質粒以及基因工程菌的構建方法。本申請同 時涉及上述重組質粒以及基因工程菌在制備發酵生物質生產四氫葉酸的生物產品中的用 途。
【背景技術】
[0002] 葉酸(folic acid)也叫維生素 B9,是一種水溶性維生素。葉酸是人體在利用糖分 和氨基酸時的必要物質，是機體細胞生長和繁殖所必需的物質。在體內葉酸以四氫葉酸的 形式起作用，四氫葉酸在體內參與嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成和轉化。
[0003] 植物和微生物細胞能利用自身的喋呤、對氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸在葉酸合成 酶的作用下從頭合成葉酸，而人和其他高等哺乳動物缺乏完整的葉酸合成系統，只能通過 食物攝取葉酸。隨著科學技術的日益發展，采用一些方法來提高食物中葉酸含量具有很大 的吸引力和極其重要的意義。
[0004] 目前國內外主要依靠化學方法合成四氫葉酸。此過程中涉及到毒性物質，并且產 品的分離純化也有不便，整個生產流程對環境有一定的污染性，成本高。而近年來對葉酸合 成代謝途徑的研究較為清楚，這為通過生物工程手段進行改造以提高葉酸含量奠定了基 礎。相比而言，用生物方法生產四氫葉酸具有不可替代的優勢，因為生物方法不像化學法一 樣，它對環境的污染可以減少到最低，而且對于生產工藝、反應條件、原料等方面的要求也 較化學法更加簡便，因此在未來有很廣泛的發展前景。
[0005]目前通過代謝工程的方法已在植物中提高了多種維生素的含量，由于葉酸對人體 健康的重要性及其代謝途徑的明了，葉酸的生物強化進展相對比較大。所涉及到的植物包 括:擬南芥、萵苣、番茄、谷類作物(水稻、玉米）、大豆。在擬南芥中Hossain等人通過大腸桿 菌來源的GCHI基因 folE轉化擬南芥，使轉基因植株的蝶呤和葉酸含量分別提高了1250倍、 2-4倍（Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:5158-5163，Hossain et al·)。在谷類作物（水 稻、玉米）中Storozhenko等人考慮到植物來源的GCHI在植物體中會受到反饋抑制，為了避 免pABA、蝶呤的過量積累，選擇AtGCHI、AtADCS在水稻中進行胚乳特異性表達，大大提高了 水稻胚乳中的葉酸含量。其中At ADCS水稻的葉酸含量降低了 6倍;AtGCHI水稻的葉酸含量沒 有明顯的變化;AtGCHI /At ADCS水稻的葉酸提高了 15-100倍。與野生型中50 %的葉酸被多聚 谷氨酰化不同，AtGCHI/AtADCS轉基因水稻中只有2.6 % -14 %的葉酸被谷氨酰化，說明轉基 因水稻中的葉酸生物利用率更高（Proc Natl Acad Sci USA，2007,101:5158-5163， Storozhenko et al.)〇
[0006]現有利用轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用提高植物葉酸含量的方法，如公 布號CN201010249764.6中所述，公開的方法是構建大豆GTPCHI和ADCS基因串聯的共表達載 體，然后導入目的植物中共表達。轉大豆GTPCHI和ADCS基因協同增效作用能夠明顯提高轉 基因植株中葉酸的含量，因此，它可以作為一種生產高含量葉酸轉基因植物的方法，人類可 通過飲食這類植物直接獲得天然的葉酸，解決葉酸攝入缺乏的現象，并克服了長期服用葉 酸片劑帶來的不良副作用。
[0007] 因此，在植物中構建基因表達用于高產四氫葉酸已經有了很大的進展，但是用植 物作為載體有很多不足：（1)植物培養不如微生物那般快捷高效，生產周期較長。（2)對產品 的實時監測也不如微生物那般便利。這導致植物中構建基因表達生產四氫葉酸很難在工業 上廣泛量產。
[0008] 目前，利用微生物生產四氫葉酸亦是一種高產四氫葉酸新思路。將大腸桿菌葉酸 代謝途徑中的關鍵酶5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的基因 metF插入載體pET-22b，構建重組 質粒pET-22b-metF，將其轉化至E. coliBL21 (DE3)中獲得基因工程菌，結果顯示，metF在大 腸桿菌中的表達對大腸桿菌生物量基本沒有影響，而L-5-甲基四氫葉酸的產量提高了28% (Pharmaceutical Biotechnology，2011，18(3):201 ~205，liu et al·)。把編碼MTHFR全長 的DNA重組到表達載體pET-28a( + )中，導入宿主菌E. coli BL21 (DE3)得到重組菌，實現利用 基因工程方法生產L-5-甲基四氫葉，結果顯示，重組菌生產的L-5-甲基四氫葉酸量約為原 始菌的2.5倍（Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2012,33(3): 185~198， liu et al.)。盡管目前利用微生物生產四氫葉酸的產量并不高，但是微生物法有不可替代 的優勢：（1)它不僅較化學法生產更加環保安全高效，而且相比于利用植株生產四氫葉酸， 微生物生產周期很快，可多次循環再利用。（2)微生物法中可對生產過程中的任何環節實時 監測，且利用微生物靈活高效。因此，我們嘗試一種可以更加高產四氫葉酸的基因工程菌的 構建。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于提供一種用于生產四氫葉酸，并降低生產成本的重組質粒和一 種高產四氫葉酸的基因工程菌。本發明的目的還在于提供一種重組質粒以及基因工程菌的 構建方法。
[0010] 本發明所用菌株是本實驗室保存的野生型大腸桿菌W3110。本發明提供的重組大 腸桿菌B S W 0 3，是含有一定拷貝數的攜帶完整的G T P環化水解酶I、二氫新蝶呤醛縮酶 (DHNA)、羥甲基二氫蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)三個基因的重組質粒的基因工程菌株W3110。
[0011] 綜上，本發明的基本技術構思是:將GTP環化水解酶I、二氫新蝶呤醛縮酶(DHNA)、 羥甲基二氫蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)這三個酶的基因插入到質粒載體pTrc99a上，再構建工 程菌BSW03,通過提高三個基因的表達以促進代謝流向四氫葉酸積累的方向，從而提高大腸 桿菌BSW03生產四氫葉酸的能力。
[0012] 針對本發明的發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0013] -方面，本發明提供了一種重組質粒，該重組質粒是攜帶有GTP環化水解酶I基因 的PMD19-T載體(pMD-GTP)。優選地，該重組質粒是攜帶完整的包括GTP環化水解酶I基因編 碼序列的PMD19-T載體，該基因的序列如SEQ ID No.l所示。
[0014] 另一方面，本發明提供了 一種重組質粒，該重組質粒是攜帶有二氫新蝶呤醛縮酶 (DHNA)基因的pMD19-T載體(pMD-DHNA)。優選地，該重組質粒是攜帶完整的包括二氫新蝶呤 醛縮酶(DHNA)基因編碼序列的pMD19-T載體，該基因的序列如SEQ ID No.2所示。
[0015] 另一方面，本發明提供了一種重組質粒，該重組質粒是攜帶有羥甲基二氫蝶呤焦 磷酸激酶(HPPK)基因的pMD 19-T載體(pMD-HPPK)。優選地，該重組質粒是攜帶完整的包括羥 甲基二氫蝶呤焦磷酸激酶(HPPK)基因編碼序列的pMD19-T載體，該基因的序列如SEQID No. 3所示
[0016]另一方面，本發明提供多種重組質粒，包括將前述的重組質粒PMD-GTP和大腸桿菌 質粒pTrc99a分別用雙切酶酶切，將切下的GTP基因片段連接的到質粒pTrc99a中而得到的 pTrc99a-G;將前述的重組質粒pMD-DHNA和前述得到的pTrc99a-G分別用雙切酶酶切，將切 下的DHNA基因片段連接的到質粒pTrc99a-G中而得到的pTrc99a-GD;以及將前述的重組質 粒pMD-HPPK和前述得到的pTrc99a-⑶分別用雙切酶酶切，將切下的HPPK基因片段連接的到 質粒 pTrc99a-GD 中而得到的 pTrc99a-GDH。
[0017]另一方面，本發明提供一種重組質粒，該重組質粒是將前述GTP、DHNA、HPPK三個基 因置于一個質粒載體上，即前述得到的pTrc99a-GDH。
[0018]另一方面，本發明提供一種四氫葉酸高產基因工程菌，所述工程菌是通過將前述 的pTrc99a-GDH重組質粒轉入到原始菌株大腸桿菌W3110中而得到的。
[0019]另一方面，本發明提供一種前述重組質粒pMD-GTP的構建方法，所述方法包括:首 先設計引物:GTP up: -5' AGGCCATGGATGCCATCACTCAGTAAAGA 3'-，劃線處