液 分散均勻，直至看不到兩相分層為止，超聲處理30min，助微球溶脹。旋轉蒸發儀除去二氯甲 燒，由于混合液中含有大量表面活性劑，二氯甲燒沸點比較低，旋蒸開始時，不需要加熱，旋 轉速度也不需要太高。待燒瓶內泡沫較少時，可適當加快旋轉速度，并適當輔W加熱，整個 旋蒸過程至少保證有30min。對所得微球進行離屯、清洗，測定固形物含量備用。 實施例8抗體偶聯 取Img憐酸基兩性離子型聚苯乙締微球（實施例1)和Img簇基兩性離子型聚苯乙締 微球（實施例2)(體積根據固含量計算）分別置于2支離屯、管中，加入1ml Mes (20mM Mes, pH 5. 6)緩沖液稀釋得乳膠溶液。從lOmg/ml的活化劑巧DC&NHS兩者等質量，Mes緩沖液 溶解，現配現用）中取IOul迅速加入膠乳溶液中，混勻，于37°C震蕩30分鐘，為保證微球 的充分反應，可采用搖床或者水浴鍋加磁力攬拌。活化結束后，取膠乳離屯、清洗，吸取上清 液，清洗一次，用200ul PB緩沖液（20mM PB,抑7. 4)復溶。取0 2-MG抗體（根據抗體濃 度，與微球的質量比為0.3 : 1)加入SOOul PB緩沖液稀釋。將上步復溶的微球溶液加入 稀釋的抗體溶液中，立刻滿旋混勻，并需要超聲將沉淀打碎，置于37°C震蕩反應2小時。反 應結束，離屯、去上清，加入封閉液（IOmM Gly, 5mg/ml BSA，0. 1% Trition和10%氯化膽堿 P冊.0)封閉，震蕩反應1小時后離屯、清洗，用封閉液復溶，清洗1次，于2-8°C保存。 W64] 兩性離子型聚苯乙締磁性微球（實施例3和實施例4)和兩性離子型聚苯乙締巧 光微球（實施例5和實施例6)的偶聯方法同上，其中兩性離子型聚苯乙締磁性微球可使用 磁分離步驟代替離屯、步驟。 實施例9 1、兩性離子型聚苯乙締微球的蛋白吸附性能 實施例1和2提供的兩性離子型聚苯乙締微球在完成與抗體結合后（參照實施例7)， 離屯、清洗時，取出上清液，采用考馬斯亮藍法測定上清液的蛋白濃度。同時設計物理吸附對 比試驗，具體方法為在MesOOmM Mes,抑5. 6)緩沖液條件下，不加入活化劑，通過微球的疏 水作用力直接與抗體蛋白結合，根據固含量，稱取一定體積的膠乳溶液，確保量取的膠乳的 質量為Ing，加入Mes緩沖液ImL。向微球溶液中加入0 2-MG抗體（根據濃度測算加入的 體積，膠乳與抗體的質量比為1 : 0. 3)，置于搖床中，溫度在30-36°C，轉速25化/min,溫育 2小時后取出。離屯、取上清測定蛋白含量。結果如下表1所示。 陽0化]表1兩性離子型聚苯乙締微球的蛋白結合率
由表1可知，通過物理吸附時，憐酸基兩性離子型聚苯乙締微球的蛋白結合量僅有 〇.〇13mg/g，通過化學偶聯時，蛋白結合量達0. 136mg/mg，而簇基兩性離子型聚苯乙締微球 有著相似的實驗結果，說明兩性離子型聚苯乙締微球由于其特殊性能，與蛋白質幾乎不發 生物理吸附，而帶有間隔臂的長鏈簇基，為共價偶聯提供了較多的集合位點，同時避免了空 間上的位阻，為抗體結合效率W及維持抗體活性提供了較好的條件。
[0066] 、兩性離子型聚苯乙締微球的免洗性能 W簇基兩性離子型聚苯乙締微球（實施例2)為例，微球的免清洗效果在NanoDrop ND-2000超微量分光光度計進行，具體方法是，在清洗后的膠乳上清液取1滴加入樣品槽 內，去除上清液后加入1血PB緩沖液（20mM PB, pH 7.4)復溶，離屯、后重復測定OD值，取S 次的數據。結果見表2。
[0067] 表2清洗次數的對比
由表2 W知，巧巧扣化的稷巷徽琢相化，阿性罔于塑萊舉臺篩徽琢卿吿曰有較強的屏 蔽作用，在偶聯后的清洗中，兩次的清洗后殘留蛋白量就已經很低了，而商品化的簇基微 球，在清洗過程中，持續有蛋白溶出，需要清洗多次。 W側、兩性離子型聚苯乙締微球在免疫比濁上的應用 W憐酸基兩性離子型聚苯乙締微球（實施例1)為例，在膠乳增強免疫比濁項目選擇 了 0 2-MG項目進行性能分析，在日立7170-A全自動生化分析儀上進行檢測，檢測參數為： 主波505,副幅波0,樣本進樣量化1，Rl進樣量240, R2進樣量60ul。其中Rl試劑為含有 2. 0%陽G6000的IOOmM PBS(pH7. 4)，R2試劑為含有膠乳儲存液W及1%疊氮鋼的致敏膠 乳溶液。標準品和質控品分別為02-MG重組蛋白，輔料為小牛白蛋白，控品由BiO-RAD公 司提供，代碼為59X。
[0069] 選取5份臨床患者樣本，分別置于樣本盤1-5號位置，W X為樣本濃度，W Y為反 應濁度，用Y對X作散點圖，作直線回歸分析，計算線性回歸方程，并考察穩定性能，結果見 表3。
[0070] 線性回歸分析 通過直線回歸等計算得到結果為：血清0 2-MG線性回歸方程為Y = 0. 98X+0. 18,相關 系數r = 0. 994，r2 = 0. 988。可認為試劑的測定范圍合適，同時說明檢測系統的線性較好， 偏差較小。
[0071] 表337°C加速穩定性能考察 凹H義化避
低濃度水平： 用濃度為4. 15mg/L的標準液作系列稀釋，檢測低濃度水平回收率。20次重復測定，理 論值為 0. 42mg/L0. 83mg/L、l. 25mg/Ll. 66mg/L、2. 08mg/L2. 49mg/L、2. 91mg/L3. 32mg/ L、3. 74mg/L、4. 15mg/L，實巧U 值為 0. 41mg/L、0. 85mg/L、l. 26mg/L、l. 66mg/L、2. 07mg/L、 2. 49mg/l、2. 91mg/l、3. 34mg/l、3. 77mg/l、4. 19mg/l，回收率為 96. 2%、101. 8%、100. 6%、 99. 9%、98. 8%、99. 9%、99. 9%、100. 4%、100. 8%、100. 5%。 陽072] 高濃度水平： 用濃度為76. 13mg/L的標準液作系列稀釋，檢測高濃度水平回收率。20次重復測定， 理論值為 7. 61mg/l、15. 23mg/l、22. 84mg/l、30. 45mg/l、38. 07mg/l、45. 68mg/l、53. 29mg/ L、60. 91mg/l、68. 52mg/l、76. 13111邑/1，實測值為 7. 61mg/l、15. 04mg/l、22. 50mg/l、30. 16mg/ ^37. 29mg/l、44. 94mg/l、53. 44mg/l、62. 00mg/l、70. 58mg/l、77. 99mg/l，回收率為 99. 9%、 98. 7%、98. 5%、99. 0%、98. 0%、98. 4%、100. 3%、101. 8%、103. 0%、102. 4%。 陽〇7引實施例10 1、兩性離子型聚苯乙締磁性微球的蛋白吸附性能 操作方法同實施例8,檢測兩性離子型聚苯乙締磁性微球對于BSA蛋白和IgG的吸附性 能，結果見表4。
[0074] 表4兩性離子型聚苯乙締磁性微球
由表4可知，橫酸基兩性離子型聚苯乙締磁性微球與憐酸基兩性離子型聚苯乙締磁性 微球有著相同的性質，對于BSA蛋白W及IgG的物理吸附量很少，而在化學偶聯時BSA蛋白 和IgG的吸附量均較多，說明與兩性離子型聚苯乙締磁性微球結合的蛋白質均W共價形式 存在，而由于兩性離子型聚苯乙締磁性微球的親水W及電中性表面，對于蛋白的物理吸附 非常少。另一方面，在進行化學偶聯時，不可避免地存在一部分物理吸附，因此按化學偶聯 時結合蛋白量為結合總量，則物理吸附時的蛋白結合量占蛋白結合總量的百分比可W計算 出，W憐酸基兩性離子型聚苯乙締磁性微球為例，其物理吸附量占總量的13%度SA) ,14% (IgG) O
[00巧]、兩性離子型聚苯乙締磁性微球在化學發光上的應用 使用憐酸基兩性離子型聚苯乙締磁性微球（實施例3)在化學發光hGH項目上進行 了試劑的性能分析測定，具體參數為：待分析樣本的加樣量為100 y L ;捕獲抗體5802抗體 的加入量為30 y L ;標記抗體5801-日丫晚醋的加入量為120 y L ;37°C溫浴反應15min，計算 0. 45~3s內的光子計數積分面積作為發光強度。
[0076] 在hGH項目上，對兩性離子型聚苯乙締磁性微球檢測試劑的最低檢測限和檢測上 限進行評估。
[0077] 兩種檢測試劑