專利名稱：一種枯草芽孢桿菌耐高溫β-淀粉酶分離純化的方法
技術領域：
本發明涉及一種野生型枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis6_7耐高溫β -淀粉酶生產工藝，具體地涉及一種發酵液高效地分離純化高酶活力β -淀粉酶的方法，屬于發酵及酶工程領域。
背景技術：
β -淀粉酶(I, 4_ a-D-glucan maltohydrolase,EC3.2.1.2),是外切型糖化酶，作用于淀粉或糖原時，從α-1，4糖苷鍵的非還原性末端依次切下麥芽糖單位，水解產物有麥芽糖、麥芽三糖、極限糊精及少量的葡萄糖。麥芽糖同時發生瓦爾登轉位反應(Waldeninversion),由α -型變為β-型,故稱β-淀粉酶。理論上β _淀粉酶能將所有的直鏈淀粉轉變為麥芽糖而將大約60%的支鏈淀粉轉變為麥芽糖剩下的轉變為糊精。β -淀粉酶廣泛存在于大麥、小麥、燕麥、大豆、甘薯等植物中，及芽孢桿菌屬(Bacillus)、耐熱梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)及霉菌等微生物中。β _淀粉酶主要用于食品工業，如高麥芽糖漿、超高麥芽糖漿、麥芽糖醇的生產。將淀粉水解為麥芽糖，麥芽糖可作為甜味劑、品質改良劑、 防腐劑、穩定劑、麥芽糖醇的前體及糖尿病治療的靜脈注射劑。β_淀粉酶還可用于啤酒行業，是麥芽最為理想的取代品。適量β_淀粉酶作用于不同玉米淀粉，可以增加抗性淀粉含量，如HylonV玉米淀粉經β -淀粉酶水解4小時后抗性淀粉RS含量高達70.7%。目前國內淀粉酶主要從植物中直接提取，如大豆、大麥、小麥、甘薯，屬于天然產品，安全，但仍存在許多不足。先將植物原料進行清洗、磨碎或碾碎，再進行漿渣分離，用水或緩沖液進行提取，操作復雜、成本高。這種從植物中直接提取純淀粉酶的方法得率低，酶的產量低，酶活力低，費時費力，而且含有一些其他可溶性成分，品質粗糙。并且植物來源的β -淀粉酶受季節影響，來源有限，不能實現工業大規模連續生產，難以實現持續化的商業利潤。且大麥、大豆等價格持續高漲,其成本愈來愈大,滿足不了對淀粉酶的需求。植物來源的β_淀粉酶耐熱性比微生物來源的差，所以開發微生物來源的β_淀粉酶分離純化方法非常重要。微生物深層發酵生產，可以實現大規模工業化自動化生產。隨著人們生活水平的提高，食品行業和啤酒行業生產的迅速發展，開發生產高質量耐高溫淀粉酶是當前研究工作的重點。針對上述植物來源生產淀粉酶存在成本高、產品雜質含量高、耐熱性差等問題，本發明提供一種野生型枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis6-7發酵液高效地分離純化耐高溫β-淀粉酶的方法。同時，本發明利用來源廣泛的木薯粉、豆柏粉作為培養基成分發酵生產β -淀粉酶，顯著降低了生產成本，為工業化生產奠定基礎。
發明內容
本發明所要解決的技術是通過一系列分離純化手段的實施，提供一種從B.subtilis6-7發酵液分離純化耐高溫β -淀粉酶的方法，該菌株在申請人此前的發明申請中(相關專利申請號:201010167019.7)已經公開了，并且此前已經提交了保藏證明和存活證明。該方法能夠得到電泳級純度的β_淀粉酶。并且純酶可以用于酶學性質的研究，能夠用于進一步的質譜鑒定分析及其他理化性質研究。為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案:以木薯粉、豆柏粉為培養基原料，配制培養基，利用優化的產酶條件進行搖瓶發酵培養。分離純化工藝特征是:(I)發酵液經4°C冷凍離心分離，收集上清液，即為粗酶液；(2)硫酸銨沉淀:在粗酶液中添加硫酸銨至飽和度為30%，4°C靜置4h，冷凍離心，去除沉淀，收集上清液；繼續添加 硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置4h，冷凍離心，去除上清液，收集沉淀，用pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液復溶；(3)透析除鹽:在同樣的pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液進行透析，用相對分子截留量為IOKDa的透析袋；(4) HiTrap Q Fast Flow:將透析樣品上樣到 HiTrap Q Fast Flow 柱陰離子交換層析積累濃縮，A 液為 pH8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4 緩沖液，B 液為 pH8.0、20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4/lmol/L NaCl緩沖液，用O lmol/L的NaCl進行線性梯度洗脫，在B液為20% 30%時，目的蛋白淀粉酶洗脫下來(如附圖1)；(5)超濾除鹽:使用超濾離心管在冷凍低溫低速下離心超濾除鹽，4°C、3800r/min離心；(6)MonoQ5/50GL:將保留液進一步通過高效率的MonoQ5/50GL柱離子交換分離(如附圖2)；(7)凝膠分子篩分離:對收集到的洗出液進一步的凝膠分子篩S^hadex G_75柱分離，去除小的雜蛋白。將純化的酶液進行SDS-PAGE電泳分析純度(如附圖3)、酶學性質研究及基質輔助激光解析飛行時間質譜鑒定分析。所述的枯草芽孢桿菌耐高溫β -淀粉酶分離純化方法，所述的優化培養獲得高產β-淀粉酶發酵液包括:(I)本發明所用的菌種為枯草芽孢桿菌B.subtilis6-7，種子培養基為LB培養基:I %胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、I % NaCl。(2)將甘油凍管保藏的菌株在10mL/50mL的LB培養基中活化培養12h，再轉接至新鮮的50mL/250mL的搖瓶LB培養基中培養12h作為二級種子。(3)優化培養基:2%木薯粉、4%豆柏粉、0.1%磷酸氫二銨、0.00139%硫酸亞鐵、
0.6%檸檬酸鈉、0.4%磷酸二氫鉀、0.0005%硫酸鋅、0.0123%硫酸鎂、0.0111 %氯化鈣，pH7.00 500mL搖瓶裝液量為250mL培養基，121°C滅菌20min。(4)將二級種子按接種量4%接種于發酵優化培養基中。轉速160r/min、培養溫度37 °C搖瓶培養60h。所述的枯草芽孢桿菌耐高溫β -淀粉酶分離純化獲得的純β -淀粉酶進行酶學性質研究包括:(I)最適反應溫度及溫度穩定性:在分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80°C測定淀粉酶活力，確定最適反應溫度；在50、55、60、65、70、751:不同溫度下處理酶液不同時間，測定殘留酶活力(如附圖4)。
(2)最適反應pH及pH穩定性:將酶液于pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中測定β -淀粉酶的活力，確定最適反應PH ;在pH3.0,4.0,5.0,6.0,7.0、
8.0下處理酶液不同時間，測定殘留酶活力(如附圖5)。(3)金屬離子及EDTA對酶活的影響:在酶反應體系中分別加入lmmol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+等8種金屬離子和EDTA。并設置不加金屬離子空白組，然后測定各組的酶活(如附圖6)。通過本發明，成功分離純化到電泳純的淀粉酶，建立了一種野生型枯草芽孢桿菌B.subtilis6-7發酵液高效地分離純化β -淀粉酶的方法，回收率高達18.66%,純化倍數為4.83，酶活達245395U/mg。
附圖1是HiTrap Q Fast Flow(強陰離子交換樹脂)離子交換層析譜圖，峰A為β -淀粉酶附圖2是monoQ5/50GL (強陰離子交換樹脂)層析譜圖，峰A為β -淀粉酶附圖3是SDS-PAGE電泳圖，甬道I 10分別為:1.B10-54發酵液；2.硫酸銨沉淀；3.DEAEpH8.0 ；4.HiTrap Q FF ρΗ8.0 ；5.HiTrap Q FF ρΗ7.5 ；6.SP ρΗ6.0 ；7.marker ； 8.sephadex G-75 ；9.monoQ ρΗ8.0 ；10.marker附圖4是β -淀粉酶溫度穩定性附圖5是β -淀粉酶pH穩定性附圖6是金屬離子及EDTA對酶活影響
具體實施例方式枯草芽孢桿菌B.subtilis6-7耐高溫β -淀粉酶分離純化方法，本發明將用實施例進行進一步的詳細說明，但不以任何方式限制本發明。實施例1微生物枯草芽孢桿菌B.subtilis6-7發酵制備發酵液粗酶液。將甘油凍管保藏的菌株B.subt i I i s6-7在10mL/50mL的LB培養基中活化培養12h，再轉接至新鮮的50mL/250mL的搖瓶LB培養基中培養12h作為二級種子。優化培養基:2%木薯粉、4%豆柏粉、0.1 %磷酸氫二銨、0.00139%硫酸亞鐵、0.6%檸檬酸鈉、0.4%磷酸二氫鉀、0.0005%硫酸鋅、0.0123%硫酸鎂、0.0111%氯化鈣，？!17.0。500mL搖瓶裝液量為250mL培養基，121 °C滅菌20min。將二級種子按接種量4%接種于發酵優化培養基中。轉速160r/min、培養溫度37°C搖瓶培養。發酵培養60h后，收集發酵液，進行4°C、8000r/min離心20min，收集上清液作為粗酶液。實施例2微生物枯草芽孢桿菌B.subtilis6-7耐高溫β -淀粉酶的分離純化。首先繪制硫酸銨鹽析曲線。取7個瓶子，分別裝等量IOOml粗酶液，按硫酸銨飽和度表加入不同的硫酸銨固體克數，分別達到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%飽和度，靜置過夜，離心收集沉淀，用ΡΗ6.0的檸檬酸緩沖液復溶，測定酶活，以初始相對酶活為100%，繪制鹽析曲線。粗酶液中加硫酸銨，依據鹽析曲線，30 %飽和度離心棄沉淀，除去雜蛋白，60 %飽和度離心收集沉淀，將目的蛋白β -淀粉酶沉淀出來。用pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液復溶沉淀，裝入分子截留量為5K的透析袋中，浸沒于同樣緩沖液中，不斷更換緩沖液，透析除鹽。將透析后的樣品上樣到HiTrap Q Fast Flow強陰離子交換柱中，A液:pH8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液、B液:A液中含lmol/L的NaCl用10個柱體積的A液平衡柱子，用ImL進樣環進樣，流速為lmL/min，接著用5個柱體積的A液洗柱，去除未結合的雜蛋白，然后根據A液、B液配比，進行O 100% B液的線性梯度洗脫。對收集到的每管流出液檢測酶活，確定目的蛋白的洗脫特征。接著對目的蛋白的流出液放在一管中，進行超濾離心管離心除鹽。將保留液上樣到MonoQ5/50GL中進行進一步高柱效的分離，操作步驟與HiTrap Q Fast Flow類似。對收集到的酶液進行凝膠分子篩分子,用pH為6.0的20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗脫，便于酶液儲存在pH6.0的緩沖液環境下。對上述純化步驟計算每一步的酶活、蛋白質含量、回收率、純化倍數。得到的β_淀粉酶回收率為18.66%，純化倍數為4.83，酶活達245395U/mg。實施例3微生 物枯草芽孢桿菌B.subtilis6-7耐高溫β -淀粉酶的酶學性質分析。最適反應溫度及溫度穩定性:在分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80°C測定β -淀粉酶活力，確定最適反應溫度；在50、55、60、65、70、75°C不同溫度下處理酶液不同時間，測定殘留酶活力。最適反應pH及pH穩定性:將酶液于pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中測定β -淀粉酶的活力，確定最適反應PH ;在？!13.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0下處理酶液不同時間，測定殘留酶活力。金屬離子及EDTA對酶活的影響:在酶反應體系中分別加入 lmmol/L 的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+ 等 8 種金屬離子和 EDTA0 并設置不加金屬離子空白組，然后測定各組的酶活。對獲得的純酶經SDS-PAGE跑膠，切膠，用100mmol/LNH4HC03/30 % ACN脫色清洗，用100%六0抑兌水，100_01/1順4!10)3、100_01/0)1'1\561:孵化301^11還原蛋白質，去上清用100% ACN 脫水，100mmol/LNH4HC03,200mmol/LIAA 暗處處理 20min，去上清加 100% ACN 脫水，凍干，加2.5ng/l.! L胰蛋白酶液4°C處理lh，再加入2 5mmo I/LNH4HCO3緩沖液，37°C反應過夜，吸出酶解液，點靶板。上機，進行質譜分析。通過質譜圖譜，可知純化的目的條帶65K左右下面一條細小條帶跟β_淀粉酶時同種蛋白，是β_淀粉酶的降解小蛋白。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌耐高溫β-淀粉酶分離純化的方法，所述的高溫β-淀粉酶來自:高產β-淀粉酶的枯草芽孢桿菌6-7，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為:CTCC Μ2009200。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型菌株6-7利用木薯粉、豆柏粉發酵生產胞外β -淀粉酶，在100mL/500mL搖瓶發酵培養。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，分離純化具體步驟包括: (1)利用優化的高產淀粉酶培養方式發酵，獲得的發酵液8000r/min、4°C冷凍離心20min ； (2)離心上清液添加硫酸銨至30%飽和度，靜置4小時，8000r/min、4°C冷凍離心20min去沉淀，除去雜蛋白； (3)繼續添加硫酸銨至60%飽和度，離心收集沉淀，使β-淀粉酶沉淀出來，用ρΗ8.0、20mmol/L 的 Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液復溶； (4)在同樣的pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液進行透析，用相對分子截留量為IOKDa的透析袋； (5)將透析樣品上樣到HiTrapQ Fast Flow柱陰離子交換層析積累濃縮，A液為ρΗ8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4 緩沖液，B 液為 ρΗ8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4/ImoI/LNaCl緩沖液，用O lmol/L的NaCl進行線性梯度洗脫，在B液為20% 30%時，目的蛋白β-淀粉酶洗脫下來； (6)將洗脫收集液用分子截留量為5Κ的超濾離心管冷凍低溫低速離心脫鹽，降低電導至NaCl含量低于50mmoI/L以下，處理保留液上樣到MonoQ5/50GL柱，A液為pH8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4 緩 沖液，B 液為 ρΗ8.0,20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4/ImoI/LNaCl 緩沖液，進一步高分辨率、高結合率精細純化； (7)根據目的蛋白分子大小65KDa左右選擇合適的凝膠柱，將洗脫收集液上樣到Sephadex G-75,進一步去除小分子雜蛋白； (8)對分離到的酶液經SDS-PAGE電泳驗證純度，得到的β-淀粉酶回收率為18.66%,純化倍數為4.83，酶活達245395U/mg。
4.對純化的電泳級β_淀粉酶酶學性質分析，其最適溫度為65°C、最適pH為6.0。
5.如權利要求4所述最適條件下測定，β-淀粉酶在65°C處理lh、2h、3h后殘留酶活分別為 72.34%,33.2%,9.36%，在50°C處理 lh、2h、3h后殘留酶活分別為 100%,99.91%,98.86% ;在37°C、4°C放置幾天酶活幾乎沒有損失。
6.如權利要求4所述，β-淀粉酶在ρΗ4、5、6、、7、8處理15h后殘留酶活為90%以上，在pH3處理15h后殘留酶活為84.95%。
7.如權利要求3所述，經純化所得β-淀粉酶在添加Mg2+、Ni2+后酶活為對照組的125.34%、123.10%，說明Mg2+、Ni2+對酶具有激活作用；在添加Mn2+、Cu2+、EDTA后，酶活為對照組的43.27%,87.93%、69%，說明Mn2+、Cu2+、EDTA對酶具有一定的抑制作用。
8.如權利要求3所述，純化的β-淀粉酶目的條帶下有一降解小條帶，基質輔助激光解析電離質譜(MALD1-T0F)分析鑒定該條帶為β-淀粉酶降解蛋白。
全文摘要
本發明屬生物工程酶制劑技術領域，涉及建立一種野生型枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis6-7發酵液分離純化耐高溫β-淀粉酶的方法。該菌已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CTCC M2009200。其特征在于采用野生型菌株B.subtilis6-7，以木薯粉、豆粕粉為碳氮源，獲得的發酵液冷凍離心、硫酸銨沉淀、透析除鹽、HiTrap Qff離子柱交換、超濾離心管超濾除鹽、monoQ5/50GL離子柱交換、Sephadex G-75分離。得到的β-淀粉酶回收率為18.66％，純化倍數為4.83，酶活達245395U/mg。對分離純化的純β-淀粉酶進行酶學性質研究，其耐熱性好，pH5-8條件下穩定，質譜鑒定為β-淀粉酶。所得的產品純度高，無色，可以達到食品級β-淀粉酶標準的要求。本發明建立的β-淀粉酶分離純化工藝簡單，便于操作，回收率高，酶活達24萬單位/毫克。
文檔編號C12N9/26GK103224920SQ201310043509
公開日2013年7月31日 申請日期2013年2月4日 優先權日2013年2月4日
發明者饒志明, 鄒艷玲, 徐美娟 申請人:江南大學