一種靈芝酸a分子印跡聚合物的制備方法及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法及其應用，它以靈芝酸A為模板分子，以氯仿為致孔劑，以丙烯酰胺為功能單體，以二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑，以偶氮二異丁腈為引發劑，制備靈芝酸A分子印跡聚合物。本發明所述方法所獲得的靈芝酸A分子印跡聚合物選擇性強，當用于定向分離靈芝中靈芝酸A時，只有靈芝酸A及與其結構高度相似的靈芝酸C2可以進入印跡聚合物的孔穴中，對靈芝酸A和靈芝酸C2選擇吸附性強，其他化合物吸附極少，分離效果顯著，且制備方法工藝步驟簡單，有機溶劑消耗少，成本低，更環保，易于實施，具有選擇性強、吸附量大、純度高等優點。
【專利說明】
一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種分子印跡聚合物的制備方法和應用，具體涉及一種靈芝酸A分子 印跡聚合物的制備方法及其應用，屬于新材料領域。
【背景技術】
[0002] 分子印跡技術(molecular imprinting technique，MIT)是一種制備對特定目標 分子具有高度特異性和選擇性分子識別材料的新興仿生技術。其基本原理是以目標化合物 為模板(template)，在適當介質中，模板分子與功能單體(functional monomer)混合，通過 共價或分子間作用力使功能單體在模板分子周圍作一定取向并排列形成分子聚集體，再進 行交聯固定，形成聚合物的模型；當模板分子被脫除以后，形成具有與模板分子空間結構互 補的特異性識別位點的分子印跡聚合物(molecular imprinted polymers，MIPs)，進而能 對模板分子進行特異性選擇結合。分子印跡聚合物是在結合位點及化學空間結構與某種特 定化合物(模板分子)相匹配的高分子聚合物。制備這種聚合物的方法即為分子印跡技術。 分子印跡技術是人工模擬抗原-抗體、生物素-抗生物素及酶與底物等之間的特異性作用發 展起來的一種分析、分離技術，主要應用于手性物質分離、仿生傳感器固相萃取等領域。 [0003] 靈芝來源于擔子菌綱多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)和紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體，是一種藥食兼用真菌。靈芝中含有多 糖、三萜、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等成分，其中三萜類化合物是靈芝具有廣泛生 理活性的重要物質基礎。現代藥理研究表明，靈芝三萜類化合物具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-1及 HIV-1蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化等作用。1982年，日本學者Kubota 首次從靈芝子實體中分離得到靈芝酸A和靈芝酸B，此后，各國學者陸續從靈芝中分離得到130 余種三萜類化合物，多數屬于高度氧化的羊毛留烷衍生物。但是，靈芝中三萜類化合物結構相 似，種類繁多，分離困難，傳統的提取分離方法大致有以下三種:1、用甲醇或乙醇提取，提取物 直接分離;2、用甲醇或氯仿提取，提取物經酸堿萃取分出總酸再進一步分離;3、用制備衍生 物的方法進行分離。但是無論采取上述何種傳統提取分離方法，均存在提取分離步驟繁瑣、 成本昂貴，有機溶劑消耗大，難以簡單快速地獲得純度較高的靈芝三萜類化合物的缺陷。
[0004] 因此，亟需提供一種新的技術方案解決上述問題，即一種靈芝酸A分子印跡聚合物 的制備方法及其應用。
【發明內容】
[0005] 1、要解決的問題
[0006] 針對現有技術中存在的上述問題，本發明提供一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制 備方法及其應用，本發明所述方法所獲得的靈芝酸A分子印跡聚合物選擇性強，當用于定向 分離靈芝中靈芝酸A時，只有靈芝酸A及與其結構高度相似的靈芝酸C2可以進入印跡聚合物 的孔穴中，對靈芝酸A和靈芝酸C2選擇吸附性強，其他化合物吸附極少，分離效果顯著，且制 備方法工藝步驟簡單，有機溶劑消耗少，成本低，更環保，易于實施，具有選擇性強、吸附量 大、純度高等優點。
[0007] 2、技術方案
[0008] 為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：
[0009] 所述的一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法，其依次按下列步驟進行制備靈 芝酸A分子的印跡聚合物：
[0010] (1)以靈芝酸A為模板分子，以丙烯酰胺為功能單體，并將所述模板分子與功能單 體混合，溶解在致孔溶劑中，形成模板分子-功能單體復合物；
[0011] (2)向步驟(1)所得的模板分子-功能單體復合物中加入引發劑、交聯劑，然后充入 氮氣脫氧15min，密封，得反應混合液，渦旋振蕩混合均勻；
[0012] (3)將步驟(2)中混合均勻的產物于45 °C恒溫水浴中加熱24h，得棒狀聚合物；
[0013] (4)將所述棒狀聚合物粉碎過篩，保留100~200目聚合物顆粒，用甲醇與乙酸按一 定比例混合的溶液置索氏提取器中，連續回流洗滌24h，除去模板分子及未反應化合物； [0014] (5)再用甲醇溶液連續回流洗滌10h，同法三次，充分洗去乙酸，聚合物晾干后于60 °(：條件下真空干燥24h至恒重，得分子印跡聚合物。
[0015] 優選地，步驟(1)中所述模板分子靈芝酸A與功能單體丙烯酰胺的摩爾比為1:6;所 述致孔劑為氯仿。
[0016] 優選地，步驟(2)中所述引發劑為2,2_偶氮二異丁腈，所述交聯劑為二甲基丙烯酸 乙二醇酯。
[0017] 優選地，所述功能單體丙烯酰胺與交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩爾比為1:5， 所述交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯與致孔劑的體積比為1.4~1.5:6，所述述模板分子靈芝 酸A與引發劑偶氮二異丁腈的質量比為25:2。
[0018] 優選地，步驟(4)中所述混合洗脫溶液中甲醇與乙酸的體積比為9:1。
[0019] 優選地，將所述靈芝酸A分子印跡聚合物作為柱層析填充料裝柱，可應用于靈芝提 取液中靈芝酸A和靈芝酸C2的定向分離和提取。
[0020] 優選地，將用于靈芝提取液中靈芝酸A和靈芝酸C2的定向分離和提取后的靈芝酸A 分子印跡聚合物用體積比為9:1的甲醇與乙酸的混合洗脫液洗脫，即可再生用于下一次靈 芝提取液中靈芝酸A和靈芝酸C2的定向分離和提取。
[0021] 3、有益效果
[0022] 相比于現有技術，本發明的有益效果為：
[0023] (1)本發明首次將分子印跡技術用于靈芝提取物中三萜類化合物的提取與分離， 與傳統方法相比，制備方法工藝步驟簡單，有機溶劑消耗少，成本低，更環保，易于實施，具 有選擇性強、吸附量大、純度高等優點；
[0024] (2)本發明所獲得的靈芝酸A分子印跡聚合物選擇性強，當用于定向分離靈芝中靈 芝酸A時，只有靈芝酸A及與其結構高度相似的靈芝酸C2可以進入印跡聚合物的孔穴中，對 靈芝酸A和靈芝酸C2選擇吸附性強，其他化合物吸附極少，分離效果顯著，因此，制得的靈芝 酸A和靈芝酸C2的純度高達98%以上，為從復雜樣品中定向分離靈芝三萜提供了可能；
[0025] (3)本發明獲得的靈芝酸A分子印跡聚合物可經甲醇-乙酸混合洗脫液洗脫再生， 再生方法簡便可行，具有良好的再生和循環使用功能。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發明所述靈芝酸A分子印跡聚合物的合成示意圖；
[0027] 圖2為本發明所述靈芝酸A分子印跡聚合物的掃描電鏡圖譜；
[0028]圖3為本發明所述靈芝酸A分子印跡聚合物的IR圖譜；
[0029]圖4為本發明空白聚合物和靈芝酸A分子印跡聚合物的吸附等溫線圖；
[0030]圖5為本發明所述靈芝酸A分子印跡聚合物吸附的Scatchard分析圖；
[0031]圖6-1為本發明靈芝總三萜HPLC色譜圖；
[0032]圖6-2為本發明靈芝總三萜經MIP吸附后三氯甲烷洗脫液HPLC色譜圖；
[0033]圖6-3為本發明靈芝總三萜經MIP純化后HPLC色譜圖。
【具體實施方式】
[0034]下面結合具體實施例對本發明進一步進行描述。
[0035] 實施例
[0036]如圖1所示，一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法，即一種能定向分離富集靈 芝酸A的分子印跡聚合物的制備方法。
[0037]以靈芝酸A為模板分子，以氯仿為致孔劑，以丙烯酰胺為功能單體，以二甲基丙烯 酸乙二醇酯為交聯劑，以偶氮二異丁腈為引發劑，制備靈芝酸A分子印跡聚合物，步驟如下： [0038] 將250mg靈芝酸A溶解在12mL氯仿中，再加入0.21g丙烯酰胺，充分振蕩30min，混勻 后加入2.82mL二甲基丙烯酸乙二醇酯，振蕩15min，使充分混合均勻，加入20mg偶氮二異丁 腈，混勻，立即充入氮氣脫氧15min，密封，得反應混合液。
[0039]將上述反應混合液45 °C恒溫水浴中加熱24h，得固體聚合物；
[0040]將上述固體聚合物粉碎并過篩，保留100~200目聚合物顆粒，然后將聚合物顆粒 用甲醇：乙酸等于9:1的混合溶液置150mL索氏提取器中連續回流24h，除去模板分子及未反 應化合物。再以甲醇連續回流l〇h，同法三次，充分洗去乙酸。聚合物晾干后60°C真空干燥至 恒重，得靈芝酸A分子印跡聚合物MIP。
[0041] -種靈芝酸A分子印跡聚合物的應用，將所述靈芝酸A分子印跡聚合物作為柱層析 填充料裝柱，可應用于靈芝提取液中靈芝酸A和靈芝酸C2的定向分離和提取。具體地，將用 于靈芝提取液中靈芝酸A和靈芝酸C2的定向分離和提取后的靈芝酸A分子印跡聚合物用體 積比為9:1的甲醇與乙酸的混合洗脫液洗脫，即可再生用于下一次靈芝提取液中靈芝酸A和 靈芝酸C2的定向分離和提取。
[0042]測試實施例
[0043]取上述聚合物進行如下測試
[0044] 1.掃描電鏡表征
[0045] 圖2是本發明合成的靈芝酸A分子印跡聚合物電鏡掃描圖。由圖2可見，聚合物表面 留有孔穴，這些孔穴有利于分子印跡聚合物的吸附作用。
[0046] 2.紅外光譜測試
[0047]圖3是分子印跡聚合物的紅外光譜圖，由圖可見，3619CHT1處是-N-H的伸縮振動吸 收峰，2987CHT1是-C-H的伸縮振動吸收峰，1732CHT1為C = 0的伸縮振動。
[0048] 3.靜態吸附實驗
[0049]精密稱取30mg印跡聚合物和非印跡聚合物各9份，振蕩分散于3mL系列濃度為0.02 ~1. Omg ? mL-1的靈芝酸A氯仿溶液中，密閉，35°C振蕩4h，吸附平衡后用0.22_微孔濾膜過 濾，HPLC測定吸附前后靈芝酸A濃度，按公式（1)計算單位質量聚合物的吸附量Q(wii 〇l ? g 4)，結果見表1、圖4。
公式（1)
[0051] 注:C總為吸附前的靈芝酸A的濃度，mol ? ml/Sc平衡為吸附后靈芝酸A的平衡濃 度，mol ?mL-Sm為聚合物的質量，mg。
[0052] 表1印跡聚合物MIP和空白聚合物NIP在25°C時的靜態吸附量
[0055] 從圖4、表1分別給出的分子印跡聚合物MIP和空白聚合物NIP對靈芝酸A的吸附等 溫線可知，MIP對模板的吸附量隨著底物初始濃度增加而增大，當底物濃度相同時，MIP的吸 附量高于NIP對同種模板分子的吸附量。表明MIP中含有大量與模板分子大小、官能團相匹 配的鍵合位點。
[0056] 采用Scatchard模型評價分子印跡聚合物對靈芝酸A的吸附參數。以Q/Op衡對Q作 圖，并根據公式(2)計算結合位點的平衡解離常數K D(mol ? ml/1)，和最大表觀吸附量Qmax(y mol ? f1)。結果見圖5。
公式（2)
[0058]圖5靈芝酸A分子印跡聚合物吸附的Scatchard分析圖表明，印跡聚合物與模板分 子有兩類結合點，高親和力結合位點的解離平衡常數為〇.〇229mmol ? I/1，最大表觀吸附量 13.12wiiol ? g_S低親和力結合位點的解離平衡常數為0.3081mmol ? I/1，最大表觀吸附量 52.75wiiol ? g_i。當模板分子濃度較低時，具有高選擇性、高親和力的結合位點吸附印跡聚 合物，不易解離；當模板分子濃度較高時，高選擇性的結合位點趨于飽和，吸附能力下降，易 解尚。
[0059] 4.應用分子印跡聚合物定向富集靈芝藥材中的靈芝三萜類化合物。
[0060]取500mg靈芝酸A分子印跡聚合物填充于固相萃取小柱中，用30ml氯仿平衡;再將 2ml 0.2g ? ml/1靈芝藥材的氯仿提取液加入到平衡好的固相萃取小柱中，用35mL氯仿洗脫， 使靈芝酸A被吸附在聚合物上并洗去非特異性吸附物質，繼續用30mL甲醇繼續洗脫。收集各 洗脫液并用旋轉蒸發儀除去溶劑，最后用2mL甲醇定容。HPLC-UV法檢測各洗脫液，結果見 圖6-1，6-2,6-3。結果顯示靈芝酸A分子印跡聚合物可除去靈芝藥材三氯甲烷提取液中絕大 多數其它三萜類化合物，可定向富集靈芝酸A和保留時間為15min極性比靈芝酸A大的另一 三萜類化合物。經與對照品保留時間及紫外圖譜比對，確定此化合物為靈芝酸C2。結論:得 到被分子印跡聚合物特異性吸附的靈芝酸A和靈芝酸C2。
[0061] 5.將上述分子印跡聚合物MIP用甲醇：乙酸(9:1)混合液洗脫，即可再生用于下一 次分咼。
[0062] 基于上述，本發明首次將分子印跡技術用于靈芝提取物中三萜類化合物的提取與 分離，與傳統方法相比，制備方法工藝步驟簡單，有機溶劑消耗少，成本低，更環保，易于實 施，具有選擇性強、吸附量大、純度高等優點；所獲得的靈芝酸A分子印跡聚合物選擇性強， 當用于定向分離靈芝中靈芝酸A時，只有靈芝酸A及與其結構高度相似的靈芝酸C2可以進入 印跡聚合物的孔穴中，對靈芝酸A和靈芝酸C2選擇吸附性強，其他化合物吸附極少，分離效 果顯著，因此，制得的靈芝酸A和靈芝酸C2的純度高達98%以上，為從復雜樣品中定向分離 靈芝三萜提供了可能；獲得的靈芝酸A分子印跡聚合物可經甲醇-乙酸混合洗脫液洗脫再 生，再生方法簡便可行，具有良好的再生和循環使用功能。
[0063] 以上示意性的對本發明及其實施方式進行了描述，該描述沒有限制性，附圖中所 示的也只是本發明的實施方式之一，實際的結構并不局限于此。所以，如果本領域的普通技 術人員受其啟示，在不脫離本發明創造宗旨的情況下，不經創造性的設計出與該技術方案 相似的結構方式及實施例，均應屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于依次按下列步驟進行制備靈 芝酸A分子的印跡聚合物： (1)以靈芝酸A為模板分子，以丙烯酰胺為功能單體，并將所述模板分子與功能單體混 合，溶解在致孔溶劑中，形成模板分子-功能單體復合物； (2) 向步驟（1)所得的模板分子-功能單體復合物中加入引發劑、交聯劑，然后充入氮氣 脫氧15 min，密封，得反應混合液，渦旋振蕩混合均勻； (3) 將步驟(2)中混合均勻的產物于45°C恒溫水浴中加熱24 h，得棒狀聚合物； (4) 將所述棒狀聚合物粉碎過篩，保留100~200目聚合物顆粒，用甲醇與乙酸按一定比 例混合的溶液置索氏提取器中，連續回流洗滌24h，除去模板分子及未反應化合物； (5) 再用甲醇溶液連續回流洗滌10h，同法三次，充分洗去乙酸，聚合物晾干后于60°C條 件下真空干燥24 h至恒重，得分子印跡聚合物。2. 根據權利要求1所述的一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，步 驟(1)中所述模板分子靈芝酸A與功能單體丙烯酰胺的摩爾比為1:6;所述致孔劑為氯仿。3. 根據權利要求1所述的一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，步 驟(2)中所述引發劑為2,2_偶氮二異丁腈，所述交聯劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯。4. 根據權利要求3所述的一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，所述 功能單體丙烯酰胺與交聯劑二甲基丙烯酸乙二醇酯的摩爾比為1:5,所述交聯劑二甲基丙 烯酸乙二醇酯與致孔劑的體積比為1.4~1.5:6,所述模板分子靈芝酸A與引發劑偶氮二異 丁腈的質量比為25: 2。5. 根據權利要求1所述的一種靈芝酸A分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，步 驟(4)中所述混合洗脫溶液中甲醇與乙酸的體積比為9:1。6. 按照權利要求1所述的一種靈芝酸A分子印跡聚合物的應用，其特征在于，將所述 靈芝酸A分子印跡聚合物作為柱層析填充料裝柱，可應用于靈芝提取液中靈芝酸A和靈芝酸 C2的定向分離和提取。7. 根據權利要求6所述的一種靈芝酸A分子印跡聚合物的應用，其特征在于，將用于 靈芝提取液中靈芝酸A和靈芝酸C2的定向分離和提取后的靈芝酸A分子印跡聚合物用體積 比為9:1的甲醇與乙酸的混合洗脫液洗脫，即可再生用于下一次靈芝提取液中靈芝酸A和靈 芝酸C2的定向分離和提取。
【文檔編號】C08J9/26GK105968257SQ201610237569
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月15日
【發明人】樂巍, 邱蓉麗, 吳玉蘭, 李璘, 邵霞
【申請人】南京中醫藥大學