一株產酸性脲酶和ec降解酶的菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】一株產酸性脲酶和EC降解酶的菌株及其應用，屬于小酶種產生菌及酶特性【技術領域】。本發明菌株命名為普羅威登斯菌（Providenciasp.）JNB815，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCCNo.8326。通過PCR擴增獲得了本菌株16SrDNA序列，序列比對分析確定為雷氏普羅威登斯菌（Providenciarettgeri）。該菌所產酶對尿素和氨基甲酸乙酯（EC）都有相對強的降解作用，而對其它酯類和氨基酸沒有降解作用，該酶對兩種底物的最適作用pH值均為4.5左右，最適溫度均為35℃；初步應用研究表明該酶在黃酒的復雜體系中仍然能有效的降解尿素和EC，且對黃酒中的風味物質幾乎無影響，此類酶的高活性安全表達與制備，能夠提升發酵食品的質量品質和安全性。
【專利說明】一株產酸性脲酶和EC降解酶的菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株產酸性脲酶和EC降解酶的菌株及其應用，具體涉及一種從小鼠的消化系統中分離出的可以產生酸性脲酶和EC降解酶的產生菌，屬于小酶種產生菌及酶特性【技術領域】。
【背景技術】
[0002]氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,簡稱EC),又稱尿燒(Urethane),早在1943年Nettleship等進行的動物實驗就證明EC具有潛在的致癌性。基因毒性和致癌性測試顯示EC是主要食源性致癌物質，它可以引起肺腫瘤、淋巴癌、皮膚癌等。根據FA0/WH0食品添加劑專家委員會2005年關于EC的食品安全評估，經食物(不包括酒精飲品)攝入的EC的量不足以對健康構成危害，但如果將經酒精飲品攝入的EC量計算在內，則人體攝入的EC總量可能對健康構成潛在危害，因此專家委員會建議采取措施適當減少酒精飲品中的EC含量。2007年，IARC正式將EC從2B類致癌物上升為2A級別，與丙烯酰胺同等危險。一般認為EC主要的致癌機理是: 氨基甲酸乙酯被細胞色素P450氧化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，后者能夠誘導Cu2+調控的DNA損傷，這種損傷多發生于胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的殘基上，進而影響生物的遺傳物質，引發癌變。
[0003]氨基甲酸乙酯的主要生成途徑:
H2NCONH2 + C2H5OH-? C2H5 O C ONH2 + NHs
黃酒的原料豐富，釀造工藝復雜，成品酒中除富含功能性營養成分和各種風味物質外，難免帶進微量的不利成分。隨著人們對食品日益更高的要求，不斷提升品質與質量也顯得尤為重要。目前的研究中對于黃酒EC的控制可分為三方面，一方面是控制原料，第二方面是改良工藝，第三方面是直接減少EC的產生。第三類方法是目前人們認為最直接有效的方式。直接減少的途徑可通過后期添加酸性脲酶，降解EC的前體物質尿素，和對已經在儲酒階段產生的EC采用相應的酶直接降解。目前國內外利用相關降解酶直接去除EC的研究報道尚比較少，該類酶的研究也相對缺乏。本發明中一株酸性脲酶和EC降解酶產生菌株的發現和對其相關的研究，能夠同時降解黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯，能夠實現從源頭到終端對EC含量的綜合控制。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種產酸性脲酶和EC降解酶的菌株，該菌所產酶在黃酒、米酒等發酵食品環境下具有較好的活性；本發明提供該菌以及該菌所產的酸性脲酶和EC降解酶的相關酶學性質及該酶在酒類中應用。
[0005]本發明的技術方案，一種酸性脲酶和EC降解酶產生菌，是從小鼠的消化系統中分離得到一株產酸性脲酶和EC降解酶的菌株，命名為普羅威登斯菌sp.)JNB815，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為=CGMCCN0.8326。[0006]從小鼠的消化系統中分離出一株可以產生酸性脲酶和EC降解酶的產生菌，該菌通過16S rDNA序列法進行系統發育樹分析并鑒定其種屬。對粗酶分析其最適溫度、最適pH、尿素和EC去除效果以及酶處理對黃酒中風味物質的影響等基本特性。
[0007]所述的產酸性脲酶和EC降解酶的菌株，通過PCR擴增獲取了 16S rDNA序列，序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0008]菌株CGMCC N0.8326所產酶的最適pH為4.5，最適溫度為35°C左右；該酶在20-60°C之間，pH值4-7之間，均具有較好的穩定性。
[0009]所述菌株產生的酶應用于降解酒類中的酸性脲酶和EC ;通過所述菌株制備粗酶液，并添加入待降解的酒樣中，加入的酶量為0.2 U/mL。所述酒類為清酒、黃酒或米酒。 [0010]本發明的有益效果:本發明分離得到的菌株，經鑒定為雷氏普羅威登斯菌，其產的酸性脲酶和EC降解酶在pH4.5-7.0之間很穩定，但當pH高于7.5或低于4.0時，酶的活力開始迅速降低直到失去活性。經試驗測定該菌產酶的最適PH為4.5，最適溫度為35°C，在25-55°C酶很穩定，當溫度高于55°C，酶的活性開始迅速降低直到失活。并對該菌產生的酶在不同酒精度中進行試驗，測得該酶對1%_15%濃度的酒精有一定耐受性。在黃酒體系中，該酶對尿素和EC都有相對較強的降解作用，但對氨基酸類成分沒有降解作用。故該普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)所產脲酶和EC降解酶有在清酒、黃酒、米酒等發酵食品中去除EC及其底物尿素的應用潛力，實現從源頭到終端對EC的控制。
[0011]生物材料樣品保藏:一株產酸性脲酶和EC降解酶的菌株，分類命名為普羅威登斯M^PiOvidenci3 sp.)JNB815,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，其保藏編號為=CGMCC N0.8326，保藏日期為2013年10月12日。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1氨離子濃度標準曲線。
[0013]圖2菌株所產EC降解酶的底物的特異性。
[0014]1、氨基甲酸甲酯；2、氨基甲酸乙酯；3、氨基甲酸丁酯；4、氨基甲酸芐酯；5、谷氨酸；6、谷氨酰胺；7、Y -氨基丁酸；8、尿素。
[0015]圖3合成引物，擴增16S rDNA序列，擴增結果。
[0016]圖4脲酶和EC降解酶反應的最適溫度。
[0017]圖5 EC降解酶反應的最適pH。
[0018]圖6脲酶反應的最適pH。
[0019]圖7尿素測定的標準曲線。
[0020]圖8尿素去除率結果。
[0021]圖9原黃酒中風味物質含量。
[0022]圖10酶處理后黃酒中風味物質含量。
【具體實施方式】
[0023]實施例1
菌株的分離:從小鼠消化系統中篩選到一株脲酶和EC降解酶產生菌。
[0024]富集培養基(g/L):葡萄糖2，EC 2，磷酸二氫鉀2，乙酸鈉2，氯化鈉5，調pH5.0，滅菌條件:115°C,20 min。
[0025]菌株的鑒定:
(I)通用引物，引物名稱:27F，1492R。
[0026](2 )提取基因組DNA。
[0027](3)合成引物，擴增16S rDNA序列，擴增結果如圖3所示。
[0028](4) PCR 產物純化。
[0029](5) PCR 產物測序。
[0030]該菌株在LB培養基上生長比較緩慢，菌落為乳白色半透明，表面光滑，邊緣整齊；在添加了 1%尿素的LB固體培養基上生長迅速，菌落直徑達到0.5cm。
[0031]洛Providencia sp.JNB815的16S rDNA序列的測序結果通過NCBI網站上的Blast程序與Genbank中核酸數據庫進行比對，發現和Fiofeflcia vermicola以及Providencia rettgeri的相似性最高。同時基于已經獲取的脲酶基因進行序列比對發現該鬼與Providenciarettgeri的相似性最高。并且兩株菌的生理生化結果一致，因此鑒定該菌株為是普羅威登斯屬iProvichnciei')中的雷氏普羅威登斯菌iProvichnciei rettger1、。
[0032]該菌通過形態觀察發現菌落形態呈圓形，乳白色半透明，邊緣整齊，革蘭氏染色實驗證明該菌為革蘭氏陰性菌。
[0033]菌株的生理生化實驗:結果如表1所示。
[0034]表1菌株的生理生化特點
【權利要求】
1.一株產酸性脲酶和EC降解酶的菌株，其分類命名為普羅威登斯菌sp.) JNB815,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為:CGMCC N0.8326。
2.根據權利要求1所述產酸性脲酶和EC降解酶的菌株，其特征在于:通過PCR擴增獲取了 16S rDNA序列 ，序列如SEQ ID N0:1所示。
3.權利要求1所述產酸性脲酶和EC降解酶的菌株的應用，其特征在于:所述菌株產生的酶應用于降解酒類中的酸性脲酶和EC ;通過所述菌株制備粗酶液，并添加入待降解的酒樣中，加入的酶量為0.2 U/mL。
4.根據權利要求3所述產酸性脲酶和EC降解酶的菌株的應用，其特征在于:所述酒類為清酒、黃酒或米酒。
【文檔編號】C12R1/01GK103937714SQ201410146266
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月14日 優先權日:2014年4月14日
【發明者】田亞平, 楊廣明, 査小紅 申請人:江南大學