專利名稱：一種保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法
技術領域：
一種保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法，具體地說是從糖類、多元醇類、 無機鹽類等幾種穩定劑中，選擇對酸性脲酶保護效果最好的穩定劑蔗糖和甘油，將蔗糖、甘油分別加入到固定化酸性脲酶酶膜中，室溫下考察其單位面積酶活力、酶活回收率、儲存穩定性、風味、多酚含量變化以及操作穩定性等方面，屬于酶制劑、食品添加劑、生物化工技術領域。
背景技術：
酶的活性功能取決于其分子完整的結構和嚴格的構像，在干燥、低溫、反復凍溶或冷凍儲存過程中會導致酶的空間結構破壞，從而喪失其原有的生物活性，酶的失活是限制酶制劑工業生產和應用的重要因素，如何提高酶的穩定性和減少酶的失活是近年來生物化工領域研究的熱點。目前，提高酶穩定性的方法主要有3種，即添加保護劑、化學修飾和固定化處理。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是將酶束縛或限制在一定區域內，仍能進行其特有的催化反應，并可回收及重復利用的一類技術。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的催化反應特性的同時，又克服了游離酶的不足，提高了酶分子結構的穩定性，簡化了生產工藝，固定化酶可在生產中反復連續使用，提高了酶的利用率。但是，酶在固定化的過程中失去活力是限制固定化酶廣泛應用的關鍵因素，采用在酶固定化過程中添加一定濃度的穩定劑，對酶、蛋白等生物活性物質起穩定保護作用，提高穩定性，降低原酶使用量，對酶的工業化生產和應用具有重要的現實意義和經濟價值。
發明內容
本發明的目的是從糖類、多元醇類、無機鹽類等幾種穩定劑中，選擇對酸性脲酶保護效果好的穩定劑，在固定化酸性脲酶酶膜中加入蔗糖和甘油為穩定劑，可以提高膜的穩定性，且此方法不影響固定化酸性脲酶酶膜的應用，不改變膜的性質及狀態，具有良好的應用前景。本發明的技術方案一種保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法，取0. Sg殼聚糖和0. Sg明膠溶于IOOmL質量濃度1%的乙酸中，將2 mL酸性脲酶溶于其中得酸性脲酶混合液，在所述酸性脲酶混合液中加入終濃度為3g/L的蔗糖或者終濃度為10%的甘油作為穩定劑，置于磁力攪拌器上，攪勻脫泡后，雙層紗布過濾，以0. 5mL濾液/cm2的量傾倒在光滑的玻璃板上，37°C自然脫水成膜，用檸檬酸緩沖液浸泡后剝離；將制好的膜剪成5 cmX5 cm 大小均勻的方塊，置于質量濃度0. 02%戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌2h，用不透明容器蓋住，以防戊二醛見光變色，去離子水洗滌，去除游離戊二醛(紫外分光光度法檢測)，浙干，得到保持穩定性的固定化酸性脲酶酶膜，所得固定化酸性脲酶酶膜置于室溫保存，定期測定酶活。所述穩定劑，其穩定劑的貯液均用pH5. 0的檸檬酸緩沖液配制，4°C儲存備用。
添加穩定劑后的酸性脲酶混合液在70°C水浴下處理池后，立即用冰水冷卻，取一定體積的該混合液稀釋10倍，用于測其酶活。將加入穩定劑的固定化酸性脲酶酶膜分別作用于30mL黃酒酒樣或30mL模擬酒酒樣中，37°C下lOOr/min搖床反應12h為一個批次，移出反應液，取樣測定酶活力、尿素去除率、多酚含量；重新加入新鮮的所述酒樣溶液，再測固定化酶活力及尿素去除率，如此反復操作并測定固定化酸性脲酶酶膜的操作穩定性。本發明一種固定化酸性脲酶酶膜穩定劑的研究，具體地說是從糖類、多元醇類、無機鹽類等幾種穩定劑中，選擇對酸性脲酶保護效果最好的穩定劑蔗糖和甘油，將蔗糖、甘油加入到固定化酸性脲酶酶膜中，室溫下考察其單位面積酶活力、酶活回收率、儲存穩定性、 風味、多酚含量變化以及操作穩定性等方面，其工藝為
A.酸性脲酶穩定劑的選擇
(1)一株產酸性脲酶菌株，其分類命名為腸桿菌屬(Enterobacter sp. )9043C12，該菌株已在《浙江農業大學學報》22 (2) :177 180，及《浙江農業大學學報》22 (5) :493 498，1996 公開。(2)穩定劑貯液均用pH5. O的檸檬酸緩沖液配制，其中糖類(葡萄糖、蔗糖)配制為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L及5 g/L不同濃度，多元醇類(甘油)配制為5%、10%、15%、20% 及25% (質量分數)濃度，山梨醇配制1 g/L、2 g/L,3 g/L、4 g/L及5 g/L，無機鹽(氯化鈉) 配制 10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L 及 50mmol/L，4°C儲存備用。將酶液和幾種穩定劑貯液分別以100:1的體積混合。將加有不同種類、不同濃度穩定劑的酶液在70°C水浴下處理池后，立即用冰水冷卻，取一定體積的混合液稀釋10倍，測其酶活。游離酶活測定方法采用靛酚藍反應(Berthelot reaction)比色法。酶活力定義在常壓，37°C，pH5. 5條件下，每分鐘分解底物尿素產生1 μ mol氨為一個酶活力單位。(3)以不加穩定劑的酶液作對照，分別考察熱穩定性，找出最適穩定劑及其最適濃度。[添加穩定劑處理后的酶活/添加穩定劑處理前的酶活]X100%=酶活保留率 (4)甘油、蔗糖對酸性脲酶酶活有很好的保護作用，甘油濃度為10%時酶活保留率為
75. 5%，是未加穩定劑的1. 2倍。蔗糖濃度為3g/L時酶活保留率為86. 9%，是未加穩定劑的 1.34倍。山梨醇在水浴處理過程中，理化特性發生了改變，對酶活出現抑制作用。乳糖和 NaCl對酸性脲酶保護作用不明顯。B、穩定劑對固定化酸性脲酶酶膜的作用
(1)取0.8g殼聚糖和0.8g明膠溶于IOOmL質量濃度1%的乙酸中，將2 mL酸性脲酶溶于其中，在混合液中加入3g/L的蔗糖或者10%的甘油，置于磁力攪拌器上，攪勻脫泡后， 雙層紗布過濾，以0. 5mL濾液/cm2的量傾倒在光滑的玻璃板上，37°C自然脫水成膜，用檸檬酸緩沖液浸泡后剝離；
將制好的膜剪成5 cmX5 cm大小均勻的方塊，浸泡在質量濃度0.02%的戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌池，去離子水洗滌，去除游離戊二醛，浙干，所得固定化膜置于室溫保存，定期測定酶活。加入穩定劑的固定化酸性脲酶酶膜酶活單位膜面積酶活分別提高2. 62倍、2. 27倍，將甘油、蔗糖混合作為穩定劑后，單位面積酶活沒有很大提高。將固定化酸性脲酶酶膜放于檸檬酸緩沖液中，室溫保存，每隔20天測定固定化酸性脲酶酶膜的酶活，60d后未加穩定劑的酶活損失34. 6%，加蔗糖為穩定劑的酶活損失 21. 8%，加甘油為保護劑的酶活損失22. 4%。固定化酸性脲酶酶活測定方法
取Icm2膜浸入一定體積的檸檬酸緩沖液配制的pH5. 5的3%尿素溶液中，在37°C恒溫水浴箱中保溫30min后，過濾取其濾液，余下的方法與游離酶活力測定相同。(2)在 100 mL制膜混合液中分別加入 lmL、l. 5mL、2mL、2. 5mL、3mL、3. 5mL、4mL酸性脲酶，按照步驟(1)中方法制膜后，考察加穩定劑和不加穩定劑時酶活回收率影響。測定可知，未加穩定劑的固定化酸性脲酶酶膜最適加酶量是IOOmL混合液加入 2mL酶液，此時酶活回收率為66. 4%，加入10%的甘油作為穩定劑，單位面積酶活提高，且酶活回收率達到82. 25%，大大提高了酶的利用率。(3)將5 cmX5 cm大小的固定化酸性脲酶酶膜放于50mL黃酒酒樣中，lOOr/min 搖床，溫度37°C，作用24h后，測定其尿素濃度，計算尿素去除率，并取處理后的酒樣測定風味物質含量、多酚含量。風味物質測定方法=HPLC-GC法測定多酚測定Folin-Ciocalteu顯色法
測定可知，處理前后尿素含量由32降至10. 2，尿素去除率達到68. 3%，處理前多酚含量為0. 348mg/mL，處理后為0. 346 mg/mL，風味物質總的種類和成分不變。(4)將5 cmX5 cm大小的固定化酸性脲酶酶膜分別作用于30mL黃酒溶液和30mL 模擬酒中(用檸檬酸緩沖液配成PH4. 5，尿素濃度為25mg · Γ1,乙醇體積分數為16%的模擬酒樣)，37°C下lOOr/min搖床反應1 為一個批次，移出反應液，取樣測定酶活力以及尿素去除率。重新加入新鮮的溶液，再測固定化酶活力及尿素去除率，如此反復操作并測定固定化酸性脲酶酶膜的操作穩定性。尿素去除率二乙酰一肟法
結果表明，在模擬酒樣中，反應13個批次后酶活力為最初的53%。在黃酒樣品中，操作穩定性有所降低，重復利用7次酶活為最初的52%。且同等條件下，在模擬酒中，前四個批次去除率可達到100%，反應10個批次后依舊可以達到67%，但在黃酒中，由于黃酒成分比較復雜，故而連續使用一定批次后，酶活大大下降，尿素去除率也僅有54. 9%。本發明的有益效果酶的活性功能決定于其分子結構的完整和嚴格的構像，在干燥成膜、反復凍溶等或冷凍儲存過程中會導致酶的空間結構破壞，從而喪失其原有的生物活性，酶在固定化的過程中失去活力是限制固定化酶廣泛應用的關鍵因素，在固定化酸性脲酶酶膜中加入蔗糖或甘油為穩定劑，可以提高膜的穩定性，且此方法不影響固定化酸性脲酶酶膜的應用，不改變酶膜的性質及狀態，具有良好的應用前景。
圖1加入穩定劑的固定化酸性脲酶酶膜制備工藝示意圖。圖2反復操作次數與尿素去除率的關系圖。圖3反復操作與固定化酶活力的關系圖。
具體實施方式
實施例1
三個燒杯中編號1、2、3，各取0. 16g殼聚糖和0. 16g明膠溶于20mL質量濃度1%的乙酸中，將0.4 mL酸性脲酶溶于其中，1號燒杯做空白對照，2號燒杯中加入3g/L的蔗糖，3號燒杯加入10%的甘油，置于磁力攪拌器上，攪勻脫泡后，雙層紗布過濾，以0. 5mL濾液/cm2的量傾倒在光滑的玻璃板上，37°C自然脫水成膜，用檸檬酸緩沖液浸泡后剝離，將制好的膜剪成5 cmX5 cm大小均勻的方塊，浸泡在質量濃度0.02%的戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌池，去離子水洗滌，去除游離戊二醛，浙干，所得固定化膜置于室溫保存，每20d 測定酶活。
權利要求
1.一種保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法，其特征在于取0. Sg殼聚糖和0. Sg明膠溶于IOOmL質量濃度1%的乙酸中，將2 mL酸性脲酶溶于其中得酸性脲酶混合液，在所述酸性脲酶混合液中加入終濃度為3g/L的蔗糖或者終濃度為10%的甘油作為穩定劑，置于磁力攪拌器上，攪勻脫泡后，雙層紗布過濾，以0. 5mL濾液/cm2的量傾倒在光滑的玻璃板上， 37°C自然脫水成膜，用檸檬酸緩沖液浸泡后剝離；將制好的膜剪成5 cmX5 cm大小均勻的方塊，置于質量濃度0. 0 戊二醛溶液中，置于磁力攪拌器上磁力攪拌池，用不透明容器蓋住，以防戊二醛見光變色，去離子水洗滌去除游離戊二醛，浙干，得到保持穩定性的固定化酸性脲酶酶膜，所得固定化酸性脲酶酶膜置于室溫保存，定期測定酶活。
2.根據權利要求1所述保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法，其特征在于所述穩定劑，其穩定劑的貯液均用PH5. 0的檸檬酸緩沖液配制，4°C儲存備用。
3.根據權利要求1所述保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法，其特征在于添加穩定劑后的酸性脲酶混合液在70°C水浴下處理池后，立即用冰水冷卻，取一定體積的該混合液稀釋10倍，用于測其酶活。
4.根據權利要求1所述保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法，其特征在于將加入穩定劑的固定化酸性脲酶酶膜分別作用于30mL黃酒酒樣或30mL模擬酒酒樣中，37°C下IOOr/ min搖床反應1 為一個批次，移出反應液，取樣測定酶活力、尿素去除率、多酚含量；重新加入新鮮的所述酒樣溶液，再測固定化酶活力及尿素去除率，如此反復操作并測定固定化酸性脲酶酶膜的操作穩定性。
全文摘要
一種保持固定化酸性脲酶酶膜穩定性的方法，屬于酶制劑、食品添加劑、生物化工技術領域。本發明向酸性脲酶中添加不同的穩定劑，從中選擇穩定效果好的蔗糖和甘油，70℃下水浴3h，酶活保留率分別是未加穩定劑的1.34倍、1.2倍。將兩種穩定劑加入固定化酸性脲酶酶膜中，100mL混合液中最適加酶量為2mL，此時未加穩定劑的酶活回收率是66.4%，加入穩定劑后酶活回收率達到82.25%。室溫下存儲60d后，未加穩定劑的酶活損失34.6%，加入蔗糖、甘油后酶活損失分別為21.8%、22.4%。在模擬酒溶液中，反應13個批次后酶活力為最初的53%；在黃酒中，重復利用7次后酶活為最初的52％。加入穩定劑不影響固定化酸性脲酶酶膜的性質及應用。
文檔編號C12N9/96GK102242109SQ201110109398
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月29日 優先權日2011年4月29日
發明者呂園園, 李欣艷, 田亞平 申請人:江南大學