靶向人jnk1基因的小干擾rna及其應用
【專利摘要】本發明涉及生物技術領域，具體是一種治療牙髓炎的靶向人JNK1基因的小干擾RNA序列及其應用，所述的小干擾RNA包括正義鏈和反義鏈，所述的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本發明獲得的小干擾RNA序列未見于以往公開的報道，能在JNK1基因的轉錄后進行干擾，降低炎癥牙髓干細胞中p?JNK的表達，特異性降低牙髓干細胞的凋亡，促進牙髓干細胞的成牙本質分化，為牙髓炎提供新的治療方案。
【專利說明】
革田向人JNK1基因的小干擾RNA及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體地說，是一種治療牙髓炎的祀向人JNK1基因的小 干擾RNA序列及其應用。
【背景技術】
[0002] 牙髓炎是最常見的口腔疾病之一，主要癥狀是疼痛，不及時治療可引起根尖周炎、 頌骨囊腫等，影響患者的口腔功能、美觀、發音和屯、理狀態，甚至成為病灶，引起低熱、腎炎、 屯、肌炎、虹膜睫狀體炎、類風濕關節炎等多種疾病，影響全身健康。離病是引起牙髓炎的主 要病因之一，細菌感染及炎性細胞的浸潤造成牙本質破壞，此時機體可形成修復性牙本質 避免牙髓受到細菌及其毒素的刺激，W維持牙體結構的完整性，但是由于牙本質的修復速 度較牙本質的破壞速度緩慢，從而導致牙體結構破壞，最終導致牙髓炎的發生。根管治療是 目前臨床上最常用的治療方法，但治療后的牙齒脆性增加、易折裂，限制其廣泛使用。因此， 充分認識炎癥狀態下修復性牙本質的形成機理及調節機制，對于防治牙髓炎的發生和發展 具有重要意義。
[0003] C-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase,JNK)又被稱為應激活化蛋白激 酉每（stress-activated protein kinase ,SAPK)是MAPK(mitogen-activated protein kinase,絲裂原活化蛋白激酶)家族主要部分，包括JNKUJNK2和JNK3^個成員，在組織中廣 泛表達。在MPK信號轉導過程中JNK可由上游激酶MKK4/SEIQ和JNKK2/MKK7激活，活化的JNK 可經核轉位進入細胞核，通過憐酸化調節轉錄因子的活性，產生一系列廣泛而重要的生物 學效應，包括炎癥發生、細胞生長、增殖、分化、細胞周期阻滯及細胞調亡等。先前的研究發 現JNK激活與牙髓細胞的成牙本質分化相關。重組人牙本質誕蛋白（Recombinant human dentin sialop;rotein，RH-DSP)能增強JNK的憐酸化，進而導致牙髓細胞的成牙本質分化增 加。Luo等研究發現，JNK抑制劑SP600125能顯著降低牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs)的成牙本質分化能力化uo Z，Kohli MR,化 Q，Kim S，Qu T，and He WX, Biodentine induces human dental pulp stem cell differentiation through mitogen-activated protein kinase and calcium-/calmodulin-dependent protein kinase II pathways.! Endod.2014;40(7) :937-942.)。胸腺素(6-4活化的DPSCs中，JNK的 憐酸化增強，當加入JNK抑制劑后，成牙本質分化水平降低。上述結果顯示JNK活化可W促進 DPSCs成牙本質分化。JNK與炎癥和細胞調亡密切相關，在慢性牙周炎的牙銀組織中，JNK表 達增加。在脂多糖（lipopolysaccha;rides，LPS)刺激的牙髓細胞中，茶多酪可通過抑制JNK 的活化抑制炎癥反應。在儒誘導的H460細胞調亡的過程中，JNK蛋白憐酸化水平明顯增高。 臨床中洛伐他汀治療屯、血管疾病誘導巨隧細胞調亡是通過Rac/Cdc42/JNK通路完成的。另 夕FJNK活化后可進入線粒體，切割Bid蛋白，促進其向線粒體轉移，激活Bax,促進細胞色素 C 的釋放，從而促進細胞調亡。
[0004] RNA干擾（RNA inteパerence，RANi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的一種生物學現象，能特 異干擾祀基因的表達。其作用機制是:核糖核酸酶HI家族的Dicer酶，與dsRNA結合，將其剪 切成21-25nt及3 ' 端突出的小干擾RNA(Smal 1 interfering RNA, siRNA)，隨后siRNA與RNA 誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結合，解旋成單鏈，活化的RISC 受已成單鏈的SiRNA引導，序列特異性地結合到祀信使RNA(mRNA化并將其切斷，引發祀 mRNA的特異性分解，從而抑制相應基因表達。目前已成為一口獨立的技術，作用祀點特異性 高、對細胞毒性小、相對安全，引起生物醫學界所有研究領域的廣泛興趣。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于W最新的JNK1基因序列為祀點，提供一種治療牙髓炎的新的特 異性抑制人JNK1基因表達的小干擾RNA序列及其應用。
[0006] 本發明的第一方面，提供一種祀向人JNK1基因的小干擾RNA的祀標基因，所述的祀 標基因的核巧酸序列為5'-61'〔667^61'〔41764146-3'，如沈〇10備:1所示。
[0007] 本發明的第二方面，提供一種祀向人JNK1基因的小干擾RNA，由下述正義鏈和反義 鏈組成：
[000引 正義鏈：5'-GAGUCGGUUAGUCAUUGAUAG-3'（沈Q ID N0:2);
[0009] 反義鏈：5'-CUAUCAAUGACUAACCGACUC-3'（沈Q ID N0:3)。
[0010] 本發明的第S方面，提供上述祀向人JNKl基因的小干擾RNA的祀標基因在制備治 療牙髓炎藥物中的應用。
[0011]本發明的第四方面，提供上述祀向人JNK1基因的小干擾RNA在制備治療牙髓炎藥 物中的應用。
[0012] 所述的祀向人JNK1基因的小干擾RNA特異性降低牙髓干細胞的調亡，促進牙髓干 細胞成牙本質分化。
[0013] 本發明的第五方面，提供一種治療牙髓炎的藥物組合物，所述的藥物組合物包括 上述祀向人JNK1基因的小干擾RNA和藥學上可接受的載體。
[0014] 所述的藥學上可接受的載體為藥學上可接受的賦形劑，懸浮劑，填充劑和/或稀釋 劑。
[001引本發明優點在于：
[0016] 本發明獲得的小干擾RNA序列未見于W往公開的報道，能在JNK1基因的轉錄后進 行干擾，降低炎癥牙髓干細胞中P-JNK的表達，特異性降低牙髓干細胞的調亡，促進牙髓干 細胞的成牙本質分化，可為治療牙髓炎提供新的方案。
【附圖說明】
[0017] 圖1是SiRNA對牙髓干細胞JNK1蛋白的下調作用。（圖示為Western blot檢測JNK1 蛋白表達量，依次為空白組，對照組和SiRNA組;GAPDH為內參。提示該SiRNA能顯著降低JNK1 蛋白的表達。）
[0018] 圖2是western blot檢測siRNA對牙髓干細胞在重度炎癥下成牙本質分化的影響。 結果表明:A為在不同濃度炎癥因子TNF-a作用下，牙髓干細胞的成牙本質能力W濃度依賴 方式降低，成牙本質標記物牙本質誕憐蛋白（dentin sialophosphop;rotein,DSPP)、牙本質 基質蛋白Udental mahix protein-l ,DMP1)的表達W濃度依賴的方式降低。B為siRNA作 用后能明顯恢復牙髓干細胞在炎癥刺激下的成牙本質分化能力，特別是在lOOng/mlTNF-a 刺激下。提示該S iRNA具有促成牙本質分化能力。
[0019] 圖3是ALP染色檢測siRNA對牙髓干細胞成牙本質分化能力的影響。結果顯示為A為 牙髓干細胞在不同濃度TNF-a刺激下成牙本質分化培養14天后ALP染色結果明顯降低。B高 濃度炎癥l(K)ng/ml TNF-a作用下，與對照組相比，給與SiRNA后能更明顯恢復牙髓干細胞的 成牙本質分化能力。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合實施例對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0021] 本發明所有方法中未注明具體條件的實驗方法，所用試劑如無特殊說明均購自 Invitrogen，干擾序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。實施例中的實驗方法通常按照 常規條件，參考分子克隆實驗指南(第=版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社， 2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0022] 實施例1:祀向人JNK1基因特異性干擾序列的獲得
[0023] 根據NCBI公開的人JNK1基因序列(GenBank: JN2 57 26 2.1)設計S i RNA序列，具體設 計參考美國 Invi trogen公司網站（其網站http : //rnaidesigner . invitrogen . com/ rnaie邱ress/so;rt. do)提供的RNAi在線設計軟件，經過比對篩選獲得含19個堿基的祀基因 序列：5 ' -GTCGGTTAGTCATTGATAG-3 '（SEQID NO: 1)，對應的siRNA干擾序列由上海吉瑪制藥 技術有限公司合成，具體如下：
[0024] 正義鏈：5'-GAGUCGGUUAGUCAUUGAUAG-3'（沈Q ID N0:2)
[0025] 反義鏈：5'-CUAUCAAUGACUAACCGACUC-3'（沈Q ID N0:3)
[00%] 實施例2:牙髓干細胞培養及Western blot檢測SiRNA對JNKl蛋白表達的效果 [0027] 1)實驗過程中的牙髓細胞來源于臨床上正常W及離病的第=磨牙和因正崎需要 拔除的第二前磨牙，患者年齡15-25歲，患者全身情況良好。取得入組人員知情同意，并經南 通大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。將拔除的牙齒立即放入冰袋預冷的基礎DMEM培養液 中（含lOOU/mL青霉素/lOOiig/mL鏈霉素）。在超凈臺上用艦伏沖洗牙齒表面后，用無菌生理 鹽水沖洗牙齒的表面至無血跡，用消毒后的咬骨錯沿釉牙骨質界打開髓腔，綴子取出牙髓， 剪去根部的牙髓組織。用3mg/mLI型膠原酶與4mg/mL的分散酶Wl:l比例混合，兩種酶W1: 10的體積與剪碎的牙髓混合消化1小時，將消化后的組織置于離屯、機中離屯、，l〇(K)rpm/min 離屯、5分鐘，棄去上清液，加完全培養基，混勻、吹打，經70WI1的細胞金屬網過濾，獲得的細胞 懸浮液接種于10cm培養皿中，加入完全培養液（10%胎牛血清、DMEM、1 %谷氨酸、1 %青霉 素/鏈霉素）。培養條件:相對濕度100 %，5 % C〇2，37 °C。3-4天半量換液，細胞融合達到70 % - 80%后，室溫條件下，0.25%膜蛋白酶消化3分鐘，lOOOr/m離屯、5分鐘，棄除上清，吹打沉淀， 混勻后W1:化k例傳代，每3天換液1次。選3代的細胞進行實驗。
[00%] 2) S iRNA轉染。實驗分為空白組(不含轉染試劑的正常細胞培養液）、對照組（陰性 對照購買自5日11*3吐此，3(3-37007)、311?酷組(合成的小干擾1?酷序列）。^0.25%膜蛋白酶 消化對數生長期的牙髓干細胞制成單細胞懸液(細胞數1 X 105)，接種于6孔板，培養至細胞 融合度大于40%。用250ul無血清培養液（Opti-MEM)稀釋siRNA(轉染細胞的終濃度為 33nM)，輕輕吹吸混勻。用250ul Opti-MEM稀釋加1 Lipofectamine TM2000,輕輕吹吸3-5次 混勻，室溫下靜置lOmin。混合轉染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸混勻，室溫下靜置20min。 500ul轉染復合物與1.5ml無血清DMEM混合后加入到24孔細胞板（lOOul/孔），輕搖細胞板混 合均勻。置于37°C、5%C02培養箱。轉染24h后換培養液，按常規條件繼續培養。
[00巧]3)Western blot檢測JNK1蛋白表達。牙髓干細胞轉染2地后，吸去培養基，PBS清洗 細胞1-2次，向細胞中加 lOOulRIPA裂解液，收集細胞至1.5ml管中，冰上靜置30min，離屯、 1200化pm，30min取上清，制備成蛋白樣品供分析。將制備的蛋白加入上樣緩沖液RSB，用100 °C煮沸5min后，立即移入冰上冷卻，作為電泳的上樣樣品。用5%濃縮膠和10%分離膠電泳 分離，上樣量為20ug/泳道，電泳電壓，濃縮膠為70V，分離膠為100V，電泳時間約2.化。內參 為 GATOH。
[0030] 結果顯示:提示該SiRNA能顯著降低JNK1蛋白的表達(見圖1)。
[0031] 實施例3:Western blot檢測SiRNA對牙髓干細胞成牙本質分化能力的影響(DPSS、 DMP-1蛋白表達）
[0032] 1)^0.25%膜蛋白酶消化對數生長期的牙髓干細胞制成單細胞懸液(細胞數IX 1〇5)，接種于6孔板，每孔200ul。37°C、5 %C〇2培養箱中培養2地后，棄上清，每孔加入400ul血 清培養基，轉染地(如前所述實驗分為空白組、對照組、S iRNA組）。
[0033] 2)牙髓干細胞轉染2地后，吸去培養基，PBS清洗細胞1-2次，向細胞中加 lOOulRIPA 裂解液，收集細胞至1.5ml管中，冰上靜置30min，離屯、12000rpm，30min取上清，制備成蛋白 樣品供分析。將制備的蛋白加入上樣緩沖液RSB，用100°C煮沸5min后，立即移入冰上冷卻， 作為電泳的上樣樣品。用5%濃縮膠和10%分離膠電泳分離，上樣量為20ug/泳道，電泳電 壓，濃縮膠為70V，分離膠為100V，電泳時間約2.化。內參為GAPDH。
[0034] 結果表明：A為在不同濃度炎癥因子TNF-a作用下，牙髓干細胞的成牙本質能力W 濃度依賴方式降低，成牙本質標記物DSPP、DMP1的表達W濃度依賴的方式降低。B為SiRNA作 用后能明顯恢復牙髓干細胞在炎癥刺激下的成牙本質分化能力，特別是在lOOng/mlTNF-a 刺激下。提示該SiRNA具有促成牙本質分化能力(見圖2)。
[0035] 實施例4: ALP染色法檢測SiRNA對牙髓干細胞成牙本質分化能力的影響
[0036] 1)^0.25%膜蛋白酶消化對數生長期的牙髓干細胞制成單細胞懸液(細胞數IX 1〇5)，接種于6孔板，每孔200ul。37°C、5 %C〇2培養箱中培養2地后，棄上清，每孔加入400ul血 清培養基，轉染地(如前所述實驗分為空白組、對照組、S iRNA組）。
[0037] 2)染色。棄上清，每孔加入200U1PBS清洗細胞1-2次，避光下用固定A液固定細胞 3min，置于37°C烘箱中；吸凈固定液，避光下用染色的夜染細胞15min，置于37°C烘箱中；吸凈 B液，再用復染的夜染細胞5min，同樣置于37°C烘箱中。最后用PBS清洗3-5次。拍照。
[0038] 結果顯示為:A為牙髓干細胞在不同濃度TNF-a刺激下成牙本質分化培養14天后 ALP染色結果明顯降低。B高濃度炎癥10化g/ml TNF-a作用下，與對照組相比，給與SiRNA后 能更明顯恢復牙髓干細胞的成牙本質分化能力(見圖3)。
[0039] W上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造并不限于所述 實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可做出種種的等同的 變型或替換，運些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
【主權項】
1. 一種靶向人JNK1基因的小干擾RNA的靶標基因，其特征在于，所述的靶標基因的核苷 酸序列如SEQ ID N0:1所示。2. -種靶向人JNK1基因的小干擾RNA，其特征在于，所述的小干擾RNA包括正義鏈和反 義鏈，所述的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示;所述的反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。3. 根據權利要求1所述的靶向人JNK1基因的小干擾RNA的靶標基因在制備治療牙髓炎 藥物中的應用。4. 根據權利要求2所述的靶向人JNK1基因的小干擾RNA在制備治療牙髓炎藥物中的應 用。5. 根據權利要求4所述的靶向人JNK1基因的小干擾RNA在制備治療牙髓炎藥物中的應 用，其特征在于，所述的靶向人JNK1基因的小干擾RNA特異性降低牙髓干細胞的凋亡，促進 牙髓干細胞成牙本質分化。6. -種治療牙髓炎的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括權利要求2所述 的靶向人JNK1基因的小干擾RNA和藥學上可接受的載體。7. 根據權利要求6所述的治療牙髓炎的藥物組合物，其特征在于，所述的藥學上可接受 的載體為藥學上可接受的賦形劑，懸浮劑，填充劑和/或稀釋劑。
【文檔編號】A61P1/02GK106047908SQ201610589788
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月25日 公開號201610589788.3, CN 106047908 A, CN 106047908A, CN 201610589788, CN-A-106047908, CN106047908 A, CN106047908A, CN201610589788, CN201610589788.3
【發明人】張冬梅, 劉曉娟, 肖靜雯, 馮興梅
【申請人】南通大學