專利名稱：一種高效基因靶向的siRNA在制備抑制腫瘤遷移藥物中的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一個生存素survivin基因為耙標的高效基因耙向的小 分子干擾RNA(siRNA)在制備抑制腫瘤遷移藥物中的用途。
背景技術：
RNA干擾技術(RNAi)是近幾年發展起來的被認為是研究功能基因組最有力工具之一。這 種新興的生物技術為腫瘤分子水平的基因治療提供了新的技術和方法。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈RNA( double stranded RNA , dsRNA) dsRNA)介導的轉錄后的基 因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)現象。通過在多種生物細胞內導入外源或內源 的dsRNA可以使內源性mRNA發生特異性降解，從而引起相應基因轉錄的阻抑。RNAi已作 為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治
療的研究中。
惡性腫瘤是當前威脅人類生命健康的主要殺手之一，目前還沒有找到真正有效的根治方 法，這迫使科研工作者不斷尋找新的技術和方法，試圖從根本上攻克癌癥。Survivin是1997 年耶魯大學Aitieric.DC等人在人類基因組庫中首先篩選分離出來的IAP(凋亡抑制蛋白)家族 的一個成員。它定位于17q25，該基因幾乎在所有種類的腫瘤組織中特異性地表達，而正常 組織幾乎沒有表達；該基因在腫瘤細胞中高表達后，不但促進腫瘤細胞抗凋亡、促進腫瘤細 胞有絲分裂、參與血管形成和放化療耐受多種功能，而引起了國內外學者的廣泛關注。
有研究者(丄ab Invest, 1999,79(11 ):1327-1333; Am J Pathol, 1998, 152(1 ):43-49)對正常 增殖細胞中survivin基因的潛在分布進行研究發現包括皮膚表面的角化細胞、腸道的上皮 細胞和正常的骨髓細胞在內，在各種有絲分裂細胞系中均沒有檢測到survWin基因的表達； survivin具有在腫瘤組織中表達特異性強、表達率高，而在正常組織中不表達的特點以及在腫 瘤的發生、發展及抗藥性等諸多方面所扮演的重要角色而使它很有可能成為腫瘤基因治療理 想的新靶點。
腫瘤的難治還在于腫瘤的天然耐藥以及后期治療時產生的耐受。腫瘤本身高表達survivin
能保護化療藥和放射線對腫瘤的殺傷:相反，不足量的化療藥或放射線也能誘導survivin的表
達，產生對治療的繼發耐受。研究表明，survivin能抑制某些化療藥物、IL-3 ， TNF-a, X射線
誘導的Fas, Caspase, Bax等參與的凋亡信號通路(Cancer Res， 1998， 58(23): 5315-5320; J Cancer
Res, 2000， 91(11):1204-1209)。但假如其唯一的BIR區發生C84A的突變，survivin也就喪失對抗化療藥物Taxol誘導的凋亡的抵抗作用。
血管形成過程取決于血管內皮細胞生存和凋亡的平衡。正常情況下，血管內皮細胞中很 難檢測到survivin。在血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的刺激下， 靜止的血管內皮表達survivin的能力約可增強4倍，VEGF的許多抗凋亡活性都是通過誘導內 皮細胞表達survivin來實現的(Am J Pathol, 2001, 158 (5): 1757-1765)。血管生成素-一 l(angi叩oietin-l， Ang-l)是胚胎血管形成過程中維持血管穩定性和管腔形成的關鍵因子。它沒 有促進內皮細胞生長，而只促進了血管網的穩定和分枝血管的形成。研究發現，Ang-1可以 促進內皮細胞中survivin表達，通過Akt(或蛋白激酶B)途徑激活survivin的抗凋亡活性，從 而阻止內皮細胞凋亡，在體內血管形成過程中穩定血管結構(J Biol Chem, 2000， 275(3): 9102-9105)。新血管生成是腫瘤生長和轉移的必要因素，因此抑制survivin的表達可能對防止 腫瘤細胞的浸潤、遷移起重要作用。己有多項動物實驗證明，反義survivin RNA或survivin 突變體可以有效抑制實體瘤的血管形成和腫瘤的侵襲增殖。因此，survivin基因可以作為腫瘤 治療的新靶點。
最早的針對survivin的RNAi研究報導于2003年，Carvalho等用小分子干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)轉染HeLa細胞，60h后蛋白印跡結果顯示治療組中己檢測不到 survivin的表達，細胞增殖明顯受抑，部分細胞有絲分裂受到阻滯，出現凋亡(J Cell Sci，2003, 1 16(14):2987-2998)。隨著RNAi技術的不斷完善，由原來直接導入外源的siRNA，發展到真 核表達載體轉錄產生siRNA，以及用于RNAi的病毒載體的出現，大大提高了轉染效率和干 擾效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核載體轉染肝細胞癌SMMC7721細胞，發 現轉染細胞中幾乎沒有survivin基因的表達，轉染細胞自發的凋亡增加，G2/M期細胞比例減 少，細胞增殖減慢(World J Gastroenterol 2005,11(5): 756-759)。目前針對survivin的RNAi研究 進展迅速，體外實驗顯示了良好的效果，相信不遠的將來會有更為豐富和完善的研究結果出 現。
應用RNA干擾技術，以小分子RNA作為靶向藥物，有針對性地對survivin基因的轉錄 后表達進行干擾，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉移時的血 管形成和降低腫瘤細胞放化療的耐受性，多層次，多途徑對腫瘤進行抑制，這可能成為了一 種新的腫瘤治療策略。而且survivin基因選擇性地表達在幾乎所有種類的腫瘤組織中，而正 常組織幾乎不表達，則可使這種基因治療對正常組織和細胞的毒副作用降到最低，應用RNAi 特異地抑制survivin等腫瘤相關基因的表達有望成為一種新的腫瘤基因治療方式。
發明內容
本發明公開了一種高效的針對survivin基因的廣譜的小分子干擾RNA (siRNA)抑制腫 瘤遷移藥物，由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成 正義鏈5'- GCAGUUUGAAGAAUUAACCtt -3'， 反義鏈5'- GGUUAAUUCUUCAAACUGQt -3' 其中X代表tt、 TT或UU。 t代表脫氧胸腺嘧啶dT。 X優選代表tt。 本發明的小分子干擾RNA是主要針對survivin基因開放閱讀框(ORF)的功能保守區設 計的雙鏈siRNA，藥理試驗證明本發明的小分子干擾RNA具有抑制腫瘤遷移作用，對乳腺癌 MDA-MB-231、胃癌MGC-803、肝癌HepG2細胞在體外均有抑制它們遷移作用，該序列的 正義鏈與survivin基因的mRNA結合，干擾survivin基因mRNA的翻譯，從而抑制腫瘤細胞 遷移，達到抑制腫瘤擴散的目的。本發明是一種全新作用機制的制腫瘤細胞遷移的新型藥物， 可能為腫瘤的治療帶來了新的希望。
本發明所述的腫瘤疾病包括乳腺癌、胃癌、肝癌細胞。
在臨床使用中，可以將本發明小分子干擾RNA (簡稱YCUsiRNAl)溶于不含RNA酶 的無菌水中，輕輕混勻，建議YCUsiRNAl為10微克/微升。取適量YCUsiRNAl與小分子干 擾脂A轉染試劑RNAi-Mate混合，在室溫溫育30分鐘，以形成YCUsiRNAl-脂Ai-Mate復 合物。將制備好的YCUsiRNAl-RNAi-Mate復合物按5-500nmol/kg靜脈給藥，一天一次，20 天左右一個療程。
具體實施例方式
實施例1
siRNA的設計與合成
儀器 OligoPilot II DNA/RNA Synthesizer (瑞典Pharmacia公司)，HP-llOO型高效液相 色譜儀(美國惠普公司)，DU2640紫外分光光度計(美國Backman公司)。
材料和試劑合成柱(6.3 mL )，分子篩(3A Sigma)， 30HL載體(批號256723)， RNA Pac PA 100分析柱(美國Dionex公司)，5種核苷酸單體(A，U,C，G,dT),乙腈，二氯乙酸，四唑,N2 甲基咪唑，除注明廠家外，其余為瑞典Pharmacia公司產品。
siRNA的設計根據survivin基因開放閱讀框(ORF)的序列，設計小分子干擾RNA YCUsiRNAl和1對負對照siRNA，將他們的序列在人類EST數據庫中比對，確定沒有與他 們相同的其它基因序列。YCUsiRNAl正義鏈5'-GCAGUUUGAAGAAUUAACCtt-3'，反義鏈5'- GGUUAAUUCUUCAAACUGCtt -3'。負對照siRNA的正義鏈5，-UUCUCCGAACGUGUC ACGUdTdT-3'，反義鏈5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3，。 siRNA的設計后送上海 吉馬公司合成。
siRNA的化學合成用乙腈將5種單體(A，U，C，G, dT)配制成0.2 mol/L溶液，分別將5 種單體、乙腈、二氯乙酸、四唑安裝到合成儀相應位置，其中單體、乙腈、四唑應加入適當 分子篩。合成歩驟(1)利用二氯乙酸處理結合于固相載體的核苷酸或寡核苷酸，脫去其5'羥 基官能團上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保護基團，露出反應性的5'端；(2)偶聯反應由四唑 催化完成，形成3' —5'磷酸酯鏈；(3)封閉反應將未反應5'羥基在N2甲基咪唑催化下由乙酸 酐來完成。RNA合成儀按照設計好的程序合成出YCUsiRNAl和負對照siRNA的單鏈RNA。 應用紫外分光光度計檢測D260nm值，并計算產量。
合成粗產品的HPLC色譜分析色譜柱DNA 2Pac PA 2100 (4mm X 250mm );樣品20 OD/m L ,進樣的量20 y L;流動相A: 25 mmol/L Tris, 1 mmol/LEDTA ， 10%乙腈，pH 8;流動 相B: 25 mmol/L Tris， 1 mmol/L EDTA ， 3 mol/L NH4C1， pH 8;洗脫梯度流動相B在40 min 內從10%到70%;流速lmL/min;檢測波長260nm;柱溫50 'C。
合成的單鏈RNA的正義鏈和反義鏈后，退火成雙鏈的YCUsiRNAI和負對照siRNA，之 后進行HPLC純化的純度大于97%的雙鏈YCUsiRNAl和負對照siRNA。
實施例2
YCUsiRNAl改變腫瘤細胞與IV型膠原蛋白間黏附能力 實驗材料
人胃癌細胞MGC-803
人乳腺癌細胞株MDA-MB-231
人肝癌細胞株HepG2
24孔培養板
Thincert侵襲小室(孔徑8pm) 主要試劑
RPMI1640培養基干粉
胰蛋白酶
MTT 主要儀器
水平電泳槽
恒溫振蕩器
中國藥科大學腫瘤藥理實驗室 中國藥科大學腫瘤藥理實驗室 中國藥科大學新藥篩選中心 Corning公司 Greincr公司
Gibco公司 Amersco公司 Sigma公司
南京大學儀器廠 上海智誠分析儀器制造公司熒光倒置顯微鏡 Leica公司 實驗方法
腫瘤細胞與IV型膠原蛋白間黏附能力的檢測
參照Herren等的方法，采用MTT法測定癌細胞與IV型膠原蛋白間的黏附能力。具體操 作如下-
IV型膠原蛋白包被96孔培養板將IV型膠原蛋白儲液用PBS稀釋成0.1 mg/mL，按 50)iL/孔加入到96孔培養板中，4 。C過夜后再于37 。C下孵育2h，然后吸去上情。
用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1.5X 104個/孔接種到己包被IV型膠原蛋白的96孔培養 板中；于37 °C, 5%C02條件下培養0.5h后，將細胞分為兩組(1)黏附細胞組，用PBS 小心洗滌2~3遍除去未黏附的細胞，然后釆用MTT法測定黏附細胞的吸光度值；(2)總細 胞組，不用PBS洗滌，直接采用MTT法測定吸光度值(A)。每組設6個平行孔。同時，測 定IV型膠原蛋白每被但未接種細胞的孔作為空白對照(control)。按照如下公式計算黏附率 (Adhesion rate):
Adhesi。n fate (%) = 1--^-^"7-x 100 。/。
實驗結果
表l小分子千擾RNA改變腫瘤細胞對IV型膠原蛋白間黏附能力_
Cdi/Ycusi歸i 0nM 25riM 50nM 100nM 150nM 200幽
MDA-MB-231 100% 45.0**±2.40/。 37.3**±2.9% 29.9**±1.7% 25.8**±3.60/0 21. i **±2.20/0 MGC-803 100% 77.1*±2.3% 69.3**±2.80/0 62.4**±2.6% 58.5**±2.1% 40.3**±2.4%
H印G2_100% 87.2±3.3°/0 78.4*±2.6% 69.3*士4.4% 66.3*±3.30/0 63.2**±3.4%
注n=8，mean±SD，重復3次，*為？<0.05 (有顯力:差異)；**^P<0.01 (有極顯著差異)
實驗結果表明小分子干擾RNA能明顯改變乳腺癌細胞MDA-MB-231、胃癌細胞MGC-803 和肝癌細胞HepG2對IV型膠原蛋白間黏附能力。
實施例3
YCUSIRNA1抑制腫瘤細胞二維水平細胞遷移能力 實驗材料與主要試劑實施例2 ' 二維水平細胞遷移實驗
參照Nakayama等的方法，采用劃痕損傷模型分析小分子千擾RNA在二維水平上對腫瘤 細胞的遷移能力的影響，操作歩驟如下
(1)用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按6X 104個/孔接種到24孔培養板中，于37 。C， 5% C02條件下培養；
(2) 次R，待細胞長成均勻單層后，用無菌的1000)iL移液器吸頭延孔的中軸線輕輕劃過。 用37 'C預熱的PBS輕輕洗滌2 3遍除去漂起的細胞殘骸后，加入37 'C預熱的培養 基，放入培養箱中繼續培養；
(3) 培養0.5 lh后(待細胞恢復)，以這一時間作為零時間點，分別在O、 12、 24h時通 過倒置顯微鏡下(50X)觀察細胞遷移情況并利用目鏡刻度尺測量劃痕寬度(S)， 每孔測量5處(即兩端、中點、左l/4處和右l/4處)求平均值，直至細胞完全匯合。 每組細胞均設三個平行孔。按照如下公式計算細胞遷移率(Migration rate):
s — s
"t"ne zero " "me point
Migration rate (%) = ^-X 100%
° time zero
表l YCUsiRNAl抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞二維水平細胞遷移能力 乳腺癌MDA-MB-231 胃癌細胞MGC-803肝癌細胞HepG2
負對照函M負對照飾M負對照100nM
Oh0.0%0.0%0.00%0.00%0.00%0,00%
12h19.6%7.3%37.9%29.3%〗0.1%5.8%
24h31.2%18.9%58.2%44.9%17.8%7,4%
36h59.9%37.3%73.0%62.7%39.2%22.5%
實驗結果表明小分子干擾RNA能明顯改變乳腺癌細胞MDA-MB-231 、胃癌細胞 MGC-803和肝癌細胞HepG2 二維水平細胞遷移能力。
實施例4
YCUsiRNAl抑制腫瘤細胞三維水平細胞遷移能力 實驗材料與主要試劑實施例2
釆用侵襲小室模型分析小分子干擾RNA在三維水平上對腫瘤細胞的遷移能力的影響，具 體操作如下
(1) 將細胞用無血清DMEM培養基培養12 h后，用0.25%胰蛋白酶消化、無血清 RPMI-1640培養基制備單細胞懸液，調整濃度為2.5Xl()S個/mL;
(2) 向24孔培養板中加入600 nL含10%小牛血清的RPMI-1640培養基，然后將Thincert 侵襲小室浸入，再向小室中加入200pL無血清單細胞懸液(即5.0乂104個細胞)；
(3) 37 °C， 5% C02培養20 h后，取出Thincert小室，用棉簽小心將膜上表面的細胞擦 拭去除；
(4) 用手術刀片小心沿小室邊緣將膜切下，把膜下表面向上放在一個潔凈的24孔培養板的孔中；
(5)將膜用甲醇冰醋酸(3: 1)固定10min，然后用10%姬姆薩染液染色15~30 min; 將膜用蒸餾水漂洗干凈后在倒青顯微鏡下(200X)隨機選取6個視野(上、下、左、右 各一，中央兩個)計數細胞(呈紫紅色)。
表1 YCUsiRNAl抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞三維水平細胞遷移能力
乳腺癌MDA-MB-231 胃癌細胞MGC-803肝癌細胞H印G2 負對照 R100nm負對照 R100nm負對照 R100nm mean 123.3 64.7 181.5 129 9 109. 3 79'7
SD 20.5 14.9 36.2 29.610-3 U-8
實驗結果表明小分子干擾RNA能明顯改變乳腺癌細胞MDA-MB-231、胃癌細胞 MGC-803和肝癌細胞HepG2三維水平細胞遷移能力。一種高效基因耙向的siRNA在制備抑制腫瘤遷移藥物中的新用途 <110>申請人姓名宜春學院
<120>發明名稱 一種高效基因靶向的siRNA在制備抑制腫瘤遷移藥物中的新用途 〈160〉序列表中序列的個數6
〈210〉序列相對應的序列標識符1 〈211〉序列長度21
〈212〉序列的類型RNA
〈213〉生物體人工序列 〈400〉序列標識符1
GCAGUUUGAAGAAUUAACCtt
〈210〉序列相對應的序列標識符2 〈211〉序列長度21 〈212〉序列的類型RNA
〈213〉生物體人工序列
〈400〉序列標識符2 GGUUAAUUCUUCAAACUGCtt
〈210〉序列相對應的序列標識符3 〈211〉序列長度21 〈212〉序列的類型RNA 〈213〉生物體人工序列 〈400〉序列標識符3 GCAGUUUGAAGAAUUAACCTT
〈210〉序列相對應的序列標識符4 〈211〉序列長度21
〈212〉序列的類型RNA
〈213〉生物體人工序列〈400〉序列標識符4 GGUUAAUUCUUCAAACUGCTT
〈210〉序列相對應的序列標識符5 〈211〉序列長度21
〈212〉序列的類型RNA
〈213〉生物體人工序列
〈400〉序列標識符5 GCAGUUUGAAGAAUUAACCUU
〈210〉序列相對應的序列標識符6 〈211〉序列長度21
〈212〉序列的類型RNA
〈213〉生物體人工序列
〈400〉序列標識符6 GGUUAAUUCUUCAAACUGCUU
權利要求
1、一種雙鏈小分子干擾RNA，其特征是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成正義鏈5′-GCAGUUUGAAGAAUUAACCtt-3′，反義鏈5′-GGUUAAUUCUUCAAACUGCtt-3′其中X代表tt、TT或UU。
2、 權利要求1的雙鏈小分子干擾RNA，其中X代表tt， t為脫氧胸腺嘧啶。
3、 權利要求1或要求2的雙鏈小分子干擾RNA在制備抑制腫癉轉移藥物中的用途。其特征 在于所述的小分子干擾RNA可以改變乳腺癌、胃癌、肝癌細胞的黏附力，顯著抑制乳腺 癌、胃癌、肝癌細胞的遷移能力。
4、 權利要求3所述的特征在于小分子干擾RNA可以改變乳腺癌、胃癌、肝癌細胞對IV型膠 原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞二維、三維水平上的遷移能力。
全文摘要
本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種高效的基因靶向小分子干擾RNA在制備抑制腫瘤轉移藥物中的用途，這種高效的基因靶向小分子干擾RNA可以沉沒survivin基因表達，改變乳腺癌、胃癌、肝癌細胞對IV型膠原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌細胞二維、三維水平上的遷移能力。這種高效的基因靶向小分子干擾RNA可以制備抑制腫瘤轉移的藥物。
文檔編號C07H21/02GK101445536SQ200810136599
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月24日 優先權日2008年12月24日
發明者陸云華 申請人:宜春學院