一種環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的制作方法

一種環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥劑領域，具體涉及一種環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 化療作為腫瘤治療的主要手段，一直存在治療效果差、副作用大的問題。臨床實驗 和研究表明，單一用藥很難對腫瘤起到顯著的治療效果，且容易產生耐藥性而降低療效，所 以聯合給藥成為腫瘤治療的一個發展方向。
[0003] 阿霉素和順鉑是兩種不同抗腫瘤機制的藥物，臨床上常聯合用于治療腫瘤，臨床 結果顯示，二者合用有協同作用。阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，但 它有很強的骨髓抑制、心臟毒性、消化道反應等毒副作用。順鉑類似于雙功能烷化劑，進入 細胞后與DNA結合，形成鉑-DNA復合體，破壞DNA的功能，阻礙DNA復制，誘導腫瘤細胞的凋 亡。雖然阿霉素和順鉑聯合用藥對腫瘤具有較好療效，但還是產生了嚴重的毒副作用和不 良反應。現有藥物制劑對病變細胞的選擇性缺失和在體循環中泄露是導致這些問題的根本 原因。因此，提高藥物制劑的體循環穩定性和對病變細胞的選擇性是化療藥物急需解決的 重要課題。
[0004] 主動靶向給藥系統是以病變細胞為靶點，能將目標藥物特異性投遞到病變細胞并 通過細胞攝取而導入胞內的給藥系統，該類系統為解決藥物制劑對病變細胞的選擇性缺失 提供了有效途徑。目前，主動靶向給藥系統大多通過納米粒子表面偶聯靶向分子或靶向基 團賦予其主動靶向功能。為了確保給藥系統高效靶向病變細胞，靶向分子或靶向基團的設 計非常關鍵。
[0005] 主動靶向給藥系統進入靶細胞后，必須能響應胞內特定環境釋放藥物。文獻報道 的藥物釋放觸發機制主要有pH敏感釋藥機制、酶敏感釋藥機制和還原敏感釋藥機制等。還 原敏感藥物載體利用細胞內外還原物質濃度的不同，使載體在腫瘤細胞中發生二硫鍵斷裂 從而將藥物快速地釋放出來。細胞中谷胱甘肽的含量(2-10mM)遠遠的高于細胞外的濃度 (接近2-20μΜ)，腫瘤細胞中谷胱甘肽的含量比正常細胞高，故設計基于二硫鍵的還原響應 性納米給藥系統，有利于實現藥物在靶細胞內的促發釋放。
[0006] 羧甲基殼聚糖是殼聚糖經羧甲基化反應后得到的一種水溶性殼聚糖衍生物，羧甲 基殼聚糖水溶性好，性質穩定，無毒，無抗原性，生物相容性好，可生物降解，在醫藥和保健 食品方面應用較為廣泛。
[0007] 近年來，分子生物學和分子病理學研究揭示，許多人體癌細胞表面的葉酸受體的 活性和數量顯著高于正常組織細胞，而葉酸對葉酸受體具有高度的親和性，所以可利用這 一特性將葉酸作為抗腫瘤藥物的靶向分子，與藥物或載體偶聯以實現藥物的靶向輸送。
[0008] 應用聚合物材料制備納米粒用于抗腫瘤藥物的傳遞是近年來藥物輸送系統研究 的熱點，但存在載藥量低等缺陷，聯合給藥可以彌補載藥量低的缺陷，同時發揮藥物的協同 作用。因此靶向聯合給藥傳遞系統在腫瘤的治療方面有著巨大的優勢。

【發明內容】

[0009] 本發明的目的是提供一種環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統及其制備方法， 該系統在用于腫瘤化療時具有明顯的優勢，對腫瘤細胞具有靶向性，而對正常細胞的毒副 作用很小。
[0010] 本發明所提供的環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統，包括由抗腫瘤藥物和用 于包封所述抗腫瘤藥物且表面偶聯靶向分子的高分子聚合物組成的納米粒，所述高分子聚 合物還通過二硫鍵與另一種抗腫瘤藥物阿霉素連接。
[0011] 所述高分子聚合物是按以下方法制備得到的：
[0012] 1)將鹽酸阿霉素與三乙胺反應得到堿基阿霉素(D0X);
[0013] 2)以3,3_二硫代二丙酸雙(N-羥基琥珀酰亞胺）酯(DSP)為交聯劑，將堿基阿霉素 與羧甲基殼聚糖反應，得到羧甲基殼聚糖-二硫鍵-阿霉素高分子聚合物(D0X-DSP-CMCS);
[0014] 3)將葉酸上的羧基氨基化，然后取10-50重量份的氨化葉酸與10-50重量份的羧甲 基殼聚糖-二硫鍵-阿霉素高分子聚合物反應，得到表面偶聯靶向分子的高分子聚合物。
[0015] 優選地，步驟3)中的反應過程是:將10-50重量份的羧甲基殼聚糖-二硫鍵-阿霉素 高分子聚合物先用水溶解，得到I _5mg/mL的水溶液，然后將10-50重量份的氨化葉酸加入到 所述水溶液中，再加入1-10重量份的1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，反應 12h，去離子水透析48h，冷凍干燥，得表面偶聯靶向分子的高分子聚合物。
[0016] 本發明所提供的環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的制備方法是:將采用上 述方法制備的20-100重量份表面偶聯靶向分子的高分子聚合物溶于水中，加入5-10重量份 抗腫瘤藥物，避光攪拌，超聲，再用去離子水透析，冷凍干燥，得到的納米粒即為環境響應性 腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統。
[0017] 本發明的有益效果在于：
[0018] 1)制備聯合給藥的納米傳遞系統
[0019] 化療藥物納米給藥系統大多是一種藥物作為模型藥物，而在腫瘤的化療治療過程 中，大多采用的是兩種藥物聯合化療，本發明通過二硫鍵將阿霉素與羧甲基殼聚糖連接，從 而合成了阿霉素的高分子前藥D0X-DSP-CMCS，并巧妙的將另一種化療藥物包封在DOX-DSP-CMCS中，從而制備出聯合給藥的納米傳遞系統。
[0020] (2)系統的體循環穩定性和智能釋藥性
[0021] 巰基-雙硫鍵交換反應具有快速、容易和可逆的特點，在動物和人體的細胞內，谷 胱甘肽是最豐富的低分子生物活性巰基物質，是最主要的還原物質。本發明通過二硫鍵設 計控釋給藥系統，從而避免納米粒在體循環中解體和藥物泄露，而一旦被受體特異性結合， 進入腫瘤細胞內，二硫鍵就會因為細胞內的還原環境斷裂并釋放藥物。因此，二硫鍵的還原 敏感機制使靶向納米粒形成良好體循環穩定性和智能釋藥性。
[0022] 試驗表明，本發明給藥系統對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，阿霉素和順鉑在模 擬血液中釋放很少，而在腫瘤細胞環境中釋放量很高，證明該給藥系統具有較好的環境響 應性。
[0023] (3)系統的廣泛適用性
[0024]本發明的靶向納米傳遞系統可通過羧甲基殼聚糖活性集團連接含-NH2或-COOH等 反應基團的不同活性物質，如腫瘤單抗、抗腫瘤化療藥和吸附基因等，從而進一步擴大其運 用范圍，具有廣泛的適用性。
【附圖說明】
[0025] 圖1是D0X-DSP-CMCS的合成路線圖。
[0026] 圖2是氨化葉酸的合成路線圖。
[0027] 圖3是表面偶聯靶向分子的高分子聚合物的合成路線圖。
[0028] 圖4是實施例1中阿霉素在不同濃度谷胱甘肽溶液中的釋藥曲線圖。
[0029] 圖5是實施例1中順鉑在不同濃度谷胱甘肽溶液中的釋藥曲線圖。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 1.高分子聚合物的制備
[0032] (l)DOX-DSP-CMCS 的合成
[0033]取鹽酸阿霉素，精密稱定，溶于純水中，加入三乙胺（鹽酸阿霉素與三乙胺摩爾比 為1:2)避光挽拌反應過夜，反應液置透析袋中純水避光透析，冷凍離心，將保留液冷凍干 燥，即得堿基阿霉素(DOX)。
[0034] 取DSP 40mg，精密稱定，溶于2.OmL二甲亞砜中，并加入0· ImL 0.1 %的三乙胺二甲 亞砜溶液。另取DOX 54mg，精密稱定，溶于2.7mL二甲亞砜溶液中，緩慢滴加到上述DSP溶液 中（DOX與DSP的摩爾比為1:0.9 )，室溫攪拌2h，即得中間體DOX-DSP。
[0035] 精密稱取DOX-DSP，溶于二甲亞砜，使得DOX濃度為10mg/mL。另精密稱取羧甲基殼 聚糖(CMCS) IOOmg，溶于去離子水中，濃度為2mg/mL，調PH至7.4，得到CMCS溶液，再緩慢滴加 1.0 mL上述DOX-DSP溶液，室溫攪拌12h，將反應液移至透析袋，用二甲亞砜水混合溶媒(去離 子水：二甲亞砜=9:1)(體積比）透析2天，蒸餾水繼續透析1天，6000rpm離心10min除去沉 淀，冷凍干燥上清液。凍干產物中加入20mL二甲亞砜溶液，超聲、過濾，除去溶于二甲亞砜的 反應物，重復3次至濾液不顯紅色。加水溶解，移至透析袋內透析1天，冷凍干燥，得到DOX-DSP-CMCS (合成路線如圖1所示）。
[0036] (2)表面偶聯靶向分子的高分子聚合物的制備
[0037] 葉酸44. lmg，溶于3mL二甲亞砜中，再加入27mg EDC和24mg N-羥基丁二酰亞胺 (NHS)，于50°C反應6h，反應液冷卻至室溫，加入66.7uL乙二胺和50uL吡啶反應過夜，用過量 乙腈沉淀產物，過濾，用乙醚洗滌，真空干燥得羧基氨基化的葉酸(合成路線如圖2所示）。
[0038] 取IOmg氨化葉酸加入到2mg/mL的D0X-DSP-CMCS水溶液（5ml)中，加入6.12mg EDC 反應12h，去離子水透析48h，冷凍干燥得表面偶聯靶向分子的高分子聚合物(合成路線如圖 3所示）。
[0039] 2.環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的制備
[0040] 取步驟1中得到的高分子聚合物IOmg分散于IOmL水中，加入順鉑2mg，避光攪拌3 天，探頭超聲30次，再用去離子水透析24h，除去過量的順鉑，冷凍干燥，制得納米粒。
[0041 ] 3.環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的腫瘤細胞毒性實驗
[0042] (1)細胞培養
[0043]將HeLa細胞置于含有10%胎牛血清的MEM培養基中，青霉素、鏈霉素濃度為IOOU/ mL，37°C，5%CO2孵化箱中連續培養，取對數生長期細胞待用。
[0044] (2)接種細胞
[0045]用0.2 5 %胰蛋白酶消化處理處于對數生長期的He La細胞，用PB S溶液洗滌， 1000 rpm離心5min后，加入新鮮培養基形成細胞懸浮液，以每孔2 X IO3個細胞(細胞密度0.2 X IO5個/mL，取IOOyL)接種于96孔培養板中，移至CO2培養箱中培養24h，培養條件:MEM培養 基，10%胎牛血清，37°C，5%CO 2。顯微鏡觀察細胞是否貼壁生長。
[0046] (3)加藥物
[0047]培養24h后，吸棄培養基，每孔中加入200yL不同濃度的納米粒懸液，繼續培養ld， 3d，5d〇
[0048] (4)呈色
[0049] 吸棄培養基，用I3BS沖洗3次，每孔加入IOOyL培養基，和IOyL CCK-8溶液，繼續孵育 4h〇
[0050] (5)比色
[0051 ]用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度，檢測波長450nm，參比波長600nm，計算細 胞存活率。
[0052] (6)實驗結果

[0054]結果表明本發明給藥系統對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，并且隨著濃度增大抑 制作用增強，隨著時間延長抑制作用也增強。
[0055] 4.環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的體外釋放實驗
[0056] 巰基-雙硫鍵交換反應具有快速、容易和可逆的特點，在動物和人體的細胞內，谷 胱甘肽是最豐富的低分子生物活性巰基物質，是最主要的還原物質，在體液或者是細胞膜 上，蛋白質是傾向于使雙硫鍵穩定的，原因就是谷胱甘肽的濃度很低。相反，在細胞內的濃 度將達到2-10mM，使得細胞內呈現出很強的還原環境。值得注意的是，腫瘤組織中的還原性 較正常組織的要高很多，其中谷胱甘肽的濃度是正常組織中的4倍多。
[0057]因此，可以通過配制不同濃度谷胱甘肽的PBS(PH7.4)溶液為釋放介質來模擬血液 和腫瘤細胞環境。取一定量的阿霉素-順鉑環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統分散于 適量PBS(PH7.4)溶液中，超聲lOmin，封裝于透析袋中，置于含谷胱甘肽分別為2μΜ、100μΜ、 2mM、IOmM的PBS(PH7.4)釋放介質中，保持恒溫37± 1°C，轉速65轉/分，分別于O、0.5、1、2、4、 8、12、24h時取透析液ImL，同時補充ImL新鮮磷酸鹽緩沖液維持釋放介質體積不變，用紫外 分光光度儀測定釋放介質中阿霉素和順鉑的釋放量，結果如圖4、圖5所示。
[0058]從圖4、5看出，阿霉素和順鉑在模擬血液(谷胱甘肽含量為2μΜ)中釋放很少，而在 腫瘤細胞環境中24小時釋放最高可以達到90%，證明該給藥系統具有較好的環境響應性。
[0059] 實施例2
[0060] 1.D0X-DSP-CMCS 的制備
[00611與實施例1的方法相同。
[0062] 2.表面偶聯靶向分子的高分子聚合物的制備
[0063] 取IOmg氨化葉酸加入到2mg/mL的DOX-DSP-CMCS水溶液（25ml)中，加入8mg EDC反 應12h，去離子水透析48h，冷凍干燥得表面偶聯靶向分子的高分子聚合物。
[0064] 3.環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的制備
[0065]取步驟2中得到的高分子聚合物20mg分散于IOmL水中，加入姜黃素2mg，避光攪拌3 天，探頭超聲30次，再用去離子水透析24h，除去過量的姜黃素，冷凍干燥，即得。
[0066] 3.腫瘤細胞毒性實驗
[0067]試驗方法與實施例1相同，試驗結果見下表。

[0069] 4.體外釋放實驗
[0070] 試驗方法和結果與實施例1相同，阿霉素和姜黃素在模擬血液(谷胱甘肽含量為2μ Μ)中釋放很少，而在腫瘤細胞環境中24小時釋放量很高，證明該給藥系統具有較好的環境 響應性。
[0071] 在本發明中，從理論上講，所包載的藥物是指腫瘤藥物，包括一般小分子藥物以及 具有生物活性的多肽蛋白類大分子藥物。在本發明的實施例中，僅對順鉑和姜黃素進行了 實驗，以此類推，本發明應該也能夠用于制備類似于5-氟尿嘧啶、紫杉醇等抗腫瘤藥物的靶 向納米粒，且取得相似的效果。
【主權項】
1. 一種環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統，包括由抗腫瘤藥物和用于包封所述抗 腫瘤藥物且表面偶聯靶向分子的高分子聚合物組成的納米粒，所述高分子聚合物還通過二 硫鍵與另一種抗腫瘤藥物阿霉素連接，所述高分子聚合物是按以下方法制備的： 1) 將鹽酸阿霉素與三乙胺反應得到堿基阿霉素； 2) 以3,3_二硫代二丙酸雙(N-羥基琥珀酰亞胺)酯為交聯劑，將堿基阿霉素與羧甲基殼 聚糖反應，得到羧甲基殼聚糖-二硫鍵-阿霉素高分子聚合物； 3) 將葉酸上的羧基氨基化，然后取10-50重量份的氨化葉酸與10-50重量份的羧甲基殼 聚糖-二硫鍵-阿霉素高分子聚合物反應，得到表面偶聯靶向分子的高分子聚合物。2. 如權利要求1所述的環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統，其特征在于:步驟3)中 的反應過程是:將10-50重量份的羧甲基殼聚糖-二硫鍵-阿霉素高分子聚合物先用水溶解， 得到l-5mg/mL的水溶液，然后將10-50重量份的氨化葉酸加入到所述水溶液中，再加入1-10 重量份的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，反應12h，去離子水透析48h，冷凍 干燥，得表面偶聯靶向分子的高分子聚合物。3. 如權利要求1所述的環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統，其特征在于:所述抗腫 瘤藥物為順鉑或姜黃素。4. 一種環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統的制備方法，其特征在于包括以下步 驟： 1) 將鹽酸阿霉素與三乙胺反應得到堿基阿霉素； 2) 以3,3_二硫代二丙酸雙(N-羥基琥珀酰亞胺)酯為交聯劑，將堿基阿霉素與羧甲基殼 聚糖反應，得到羧甲基殼聚糖-二硫鍵-阿霉素高分子聚合物； 3) 將葉酸上的羧基氨基化，然后取10-50重量份的氨化葉酸與10-50重量份的羧甲基殼 聚糖-二硫鍵-阿霉素高分子聚合物反應，得到表面偶聯靶向分子的高分子聚合物。 4) 取20-100重量份高分子聚合物分散水中，加入5-10重量份抗腫瘤藥物，避光攪拌，超 聲，再用去離子水透析，冷凍干燥，得到的納米粒即為環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系 統。
【專利摘要】本發明公開了一種環境響應性腫瘤靶向聯合給藥傳遞系統，本發明通過二硫鍵將阿霉素與羧甲基殼聚糖連接，從而合成了阿霉素高分子前藥，并巧妙的將另一種化療藥物包封在阿霉素高分子前藥中，從而制備出聯合給藥的納米傳遞系統，該系統具有良好的體循環穩定性和智能釋藥性，藥物成分在模擬血液中釋放很少，而在腫瘤細胞環境中釋放量很高，同時還具有廣泛的適用性。
【IPC分類】A61K47/48, A61P35/00, A61K31/704, A61K31/12, A61K33/24
【公開號】CN105708848
【申請號】CN201610079030
【發明人】劉詩久, 張政, 張雪瓊
【申請人】武漢艾美博特醫療用品有限公司