一種基于貴金屬納米陣列和sers技術的dna芯片的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型涉及生物檢測、生物技術和納米技術領域，尤其涉及一種基于貴金屬 納米陣列和SERS技術的DNA芯片。
【背景技術】
[0002] DNA芯片又稱基因芯片（genechip)是生物芯片的一種，是指將大量探針分子固定 于支持物上，根據堿基互補配對原理，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號的強 度及分布進而得到靶分子的序列和數量的信息。DNA芯片的支持物包括玻片、硅片、NC膜、 Nylon膜等。DNA芯片技術可廣泛應用于疾病診斷和治療、農作物的優育優選、司法鑒定、食 品衛生監督、環境檢測等許多領域。目前DNA芯片的檢測技術包括熒光、質譜以及同位素標 記，其中熒光是最主要的檢測方法。但這些方法存在一些局限性，例如：熒光的光譜譜帶較 寬，從而限制了對體系的多重檢測；不同熒光染料需要不同波段的激發光激發，增加了檢測 成本；熒光染料在激發光的激發下容易出現光漂白的現象等。
[0003] 表面增強拉曼光譜（SERS)技術是一種先進的無損檢測技術，它是當分子吸附在 一些特殊金屬（主要為貴金屬）或半導體納米結構表面時，其拉曼散射信號被增強多個數 量級的現象。SERS為Surface-enhanced Raman scattering的英文縮寫，中文意義為表面 增強拉曼散射。它具有快速、簡單、靈敏度高、指紋識別以及可重復性好的優勢。SERS技術 已經得到廣泛，在化學、生物和醫學以及環境等領域都發揮著越來越重要的作用。相比于熒 光，SERS的具有豐富的特征拉曼光譜線，且拉曼光譜譜帶窄，能夠為分析物提供更加豐富的 結構信息。現在利用SERS在一些體系中甚至能達到單分子水平的檢測靈敏度。但是，目 前還沒有出現利用SERS技術而設計的基因芯片。 【實用新型內容】
[0004] 本實用新型的目的在于利用貴金屬納米陣列和表面增強拉曼光譜（SERS)技術而 設計一種基于貴金屬納米陣列和SERS技術的DNA芯片，實現目標DNA和基因的檢測和分 析。
[0005] 本實用新型是通過以下技術方案實現的：一種基于貴金屬納米陣列和SERS技 術的DNA芯片：該DNA芯片的襯底為以貴金屬納米陣列為襯底的SERS襯底，SERS為 Surface-enhanced Raman scattering的英文縮寫，中文意義為表面增強拉曼散射；在貴 金屬納米列陣上劃分有若干區域，在每個區域的表面上修飾連接有不同的若干DNA探針使 DNA芯片成為含有不同探針DNA的芯片。
[0006] 作為上述方案的進一步改進，探針DNA的一端修飾巰基，通過巰基使得探針DNA與 SERS襯底結合在一起。
[0007] 作為上述方案的進一步改進，所述貴金屬納米陣列為金Au納米陣列。
[0008] 作為上述方案的進一步改進，所述貴金屬納米陣列為銀Ag納米陣列。
[0009] 作為上述方案的進一步改進，SERS襯底還包括AA0模板，AA0是Anodic Aluminum Oxide Template的英文縮寫，中文意義為陽極氧化錯模板，貴金屬納米陣列設置在AAO模 板上。
[0010] 優選地，貴金屬納米陣列采用電鍍或濺射的方式設置在AA0模板上。
[0011] 本實用新型利用SERS技術，設計以貴金屬金（Au)或銀（Ag)納米陣列為襯底的 DNA芯片。在制作時可選取或自行制備貴金屬納米陣列，然后在納米陣列不同區域的表面修 飾連接不同探針DNA，在使用時可根據DNA堿基互補配對的原理利用這些探針DNA對目標 DNA進行檢測，再根據實際需要，進一步滴加具有特征拉曼信號的報告DNA，并根據DNA雜交 前后芯片上的SERS信號（包括頻率、強度）變化、差異來實現對目標DNA的識別和定量檢 測。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本實用新型較佳實施例提供的DNA芯片的DNA檢測原理示意圖。
[0013] 圖2為本實用新型較佳實施例提供的DNA芯片的制作及檢測流程示意圖。
[0014] 圖3為圖2中DNA芯片的結構示意圖。
[0015] 圖4為DNA芯片的錐形孔AA0模板制備流程圖。
[0016] 圖5為DNA芯片的具有格子狀Ag納米柱陣列的SERS襯底的制備流程示意圖。
[0017] 圖6為利用DNA芯片的探針DNA直接檢測目標DNA時的光譜圖，具體的光譜為：底 部為探針DNA的SERS光譜；頂部為探針DNA與不同濃度目標DNA雜交后的SERS光譜。
[0018] 圖7為在DNA芯片上連接探針DNA的SERS襯底上滴加待測的目標DNA，然后檢測 與目標DNA部分片段互補配對報告DNA的SERS信號圖，SERS信號為：底部光譜為報告DNA 未經任何處理直接測試得到的SERS信號；頂部光譜為檢測不同濃度下目標DNA的SERS信 號。
[0019] 圖8為檢測目標DNA與報告DNA混合后的SERS信號圖。
【具體實施方式】
[0020] 為了使本實用新型的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施實例，對 本實用新型進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本實 用新型，并不用于限定本實用新型。
[0021] 首先申明本發明中的DNA有三種：探針DNA、目標DNA、以及報告DNA。其中探針DNA 用來捕獲目標DNA，報告DNA用來發出探測信號的。請一并參閱圖1、圖2、圖3,本實用新型 的DNA芯片，其襯底為以貴金屬納米陣列為襯底的SERS襯底；在貴金屬納米列陣上劃分有 若干區域，在每個區域的表面上修飾連接有不同的若干DNA探針，使DNA芯片成為含有不同 探針DNA的芯片（如圖3所示）。利用這些DNA探針對目標DNA進行檢測產生SERS信號， 根據SERS信號的頻率變化、幅值差異來實現對目標DNA的識別以及定量檢測（如圖2所 示）。
[0022] 本實用新型的DNA芯片的基本原理如圖1所示：選取或自行制備貴金屬納米陣列， 然后在納米陣列不同區域的表面修飾連接不同探針DNA，然后根據DNA堿基互補配對的原 理利用這些探針DNA對目標DNA進行檢測，再根據實際需要，進一步滴加具有特征拉曼信號 的報告DNA，并根據DNA雜交前后芯片上的SERS信號（包括頻率、強度）變化、差異來實現 對目標DNA的識別和定量檢測，主要指頻率變化、幅值差異。
[0023] 如圖2所示，本實用新型利用商業貴金屬（Au或Ag)納米陣列作為DNA芯片的 襯底，或者，可以自己利用AA0模板方法制備得到排列整齊、間距合適、SERS活性強的金 或銀的貴金屬納米陣列作為DNA芯片的襯底，其中金、銀納米陳列可以通過電鍍或濺射的 方法得到。在貴金屬納米列陣上劃分大小合適的小區域（在圖中標注為11，12，13 ;… 21，22, 23…;31，32, 33…），在每個區域上可以連接上不同的DNA探針，連接方法可以用巰基 連接的方式，從而得到適用于SERS測量的DNA芯片。
[0024] 在DNA芯片上滴加含有目標DNA的溶液，在合適的條件下（等待時間、溫度等），使 不同的探針DNA與相應的目標DNA進行互補配對，然后檢測雜交后的SERS信號，并分析芯 片上的DNA的SERS信號（包括頻率、強度）變化、差異，初步判斷檢測目標DNA的情況。
[0025] 可在DNA芯片上滴加或浸泡與目標DNA某一段互補配對的報告DNA，其一端帶有 容易產生SERS信號的分子基團，然后通過檢測報告DNA的SERS信號，達到檢測和識別目標 DNA的目的。
[0026] 本實用新型以在錐形孔AA0模板表面通過離子濺射的方法得到的Ag納米柱陣列 為SERS襯底，制備了基于SERS技術的DNA芯片（原理性實驗），具體步驟如下：
[0027] 1、表面帶有納米尖端結構錐形孔AA0模板的制備
[0028] (1)AA0模板的一次氧化：將拋光后的高純鋁片在0? 3M的草酸溶液中用40V直流 電壓陽極氧化6h，然后在60°C的6wt %磷酸和1. 8wt %鉻酸的混和溶液中浸泡9h，以除去 第一次陽極氧化在高純鋁片表面獲得的不規則孔的氧化鋁膜。
[0029] (2)表面帶有尖端納米結構的AA0模板的制備：具體的制備方法如圖4所示，圖4 為錐形孔AA0模板制備流程圖。將步驟（1)中所得到的鋁基底利用交叉氧化擴孔的方法制 備表面具有尖端納米結構的氧化鋁模板。首先把鋁基底在0. 3M的草酸溶液中用40V直流 電壓陽極氧化40s，接著把所得到的模板在40°C下5%的磷酸溶液中擴孔2min，重復交替上 述氧化和擴孔過程18次。
[0030] 2、劃分不同區域的格子及Ag納米柱陣列的制備
[0031] 如圖5所示，圖5為格子狀Ag納米柱陣列DNA芯片SERS襯底的制備流程示意圖， 主要包括對1中得到的模板進行光刻處理以及離子濺射兩個步驟。
[0032] (1)AA0模板的光刻處理
[0033] 將1中制備的錐形孔AA0模板置于旋涂儀上，在4000轉每分鐘的轉速下，滴加2mL 正性光刻膠于模板上，旋涂光刻