-腎上腺素能受體近紅外熒光配體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物技術領域，具體涉及一類環境敏感型的a 腎上腺素能受體近紅 外熒光探針以及其在α /皆上腺素受體細胞成像、亞細胞定位和表達水平檢測等藥理學和 生理學研究中的應用。
【背景技術】
[0002] 具有7次跨膜結構的G-蛋白偶聯受體，是最大的細胞表面受體家族，其編碼基因 約占人類蛋白編碼基因組的4%[211&1^，1?.;父16，父.1'0018；1^016?01?(11'1^(118(30￥6^.厶(^已 Pharmacol. Sin. 2012, 33, 372-84.]。作為一種多功能的分子機器，G-蛋白偶聯受體調節 著由激素和神經遞質介導的大多數生理反應，是將近26%上市處方藥物的作用靶點。盡 管G-蛋白偶聯受體的化學與結構生物學研究取得了可喜的進展，但是由于動態受體的構 象多樣性，其藥理學及其生理學研究仍存在著很大的挑戰[Granier, S.，Kobilka, B. A new era of GPCR structural and chemical biology. Nat. Chem. Biol. 2012, 8, 670-673.]。 為了開發出用作受體研究的有效工具，熒光標記的藥物分子，即小分子熒光配體越來與受 到藥物學家的關注。過去的幾十年里，大量的G-蛋白偶聯受體的小分子熒光配體被相繼 報道出來，而且已經廣泛地應用于細胞水平的受體可視化和藥理學研究[Ma，Z. ;Du，L.; Li, M. Toward fluorescent probes for G-protei-coupled peceptors (GPCRs). J. Med. Chem. 2014,57,8187-8203.]。然而，這些小分子熒光配體仍然存在的局限。一方面大多數 已報道的熒光配體的熒光波長較短，常與細胞或組織本身的自發熒光產生干擾，而且這些 短波的光穿透力弱，無法有效的透過深層組織，限制了其廣泛應用。另一方面，傳統的熒光 配體缺乏一種有效的熒光開關機制，從而產生較強的非特異性結合信號，導致信噪比較差。
[0003] 腎上腺素能受體是介導兒茶酚胺作用的一類組織受體，隸屬于G-蛋白偶聯家 族，分為α和β兩種亞型，是交感神經系統反應的重要介質。Ci1-腎上腺素能受體包含 三種亞型：α η、α 1Β和 a 1D[Zhong, H. ；Minneman, K. P. Alphal-adrenoceptor subtypes. Eur. J. Pharmacol. 1999, 375, 261-276]，主要調節平滑肌收縮、心肌收縮和肝臟葡萄糖代 謝。研究表明，Ct1-腎上腺素能受體是治療良性前列腺增生（BPH)和高血壓的藥理靶點 [Rosini, M. ；Bolognesi, M. L. ；Giardina, D. ；Minarini, A. ；Tumiatti, V. ；Melchiorre, C. Recent advances inalpha1-adrenoreceptor antagonists as pharmacological tools and therapeutic agents. Curr. Top. Med. Chem. 2007, 7, 147-162]。此外，研究還發現， a f腎上腺素能受體在前列腺腫瘤組織中高度表達，其拮抗劑對雄激素依賴和非依賴前列 腺癌細胞都有促凋亡作用。a i-腎上腺素能受體的不正常表達及分布于許多生理疾病息息 相關，例如高血壓、前列腺肥大、前列腺癌等。
[0004] 相比于腎上腺素能受體家族的其他成員如β受體，a i-腎上腺素能受體的藥理學 和生理學特征研究相對滯后。目前運用藥理學手段研究Ci1-腎上腺素能受體具有一定的 難度，這是因為a f腎上腺素能受體拮抗劑雖然在活性上較以前有了很大的改善，但在組 織選擇性方面仍有待進一步優化；另一方面，a f腎上腺素能受體的三維晶體結構尚未解 析，很難從基于分子水平對這些實驗現象進行解釋。因此開發出高靈敏的Ci1-腎上腺素能 受體的小分子熒光配體顯得尤為重要。雖然近幾年有不少Ct1-腎上腺素能受體熒光探針 相繼問世，但他們都存在著上述傳統熒光探針的缺點，即波長短且缺乏熒光開關機制。這些 缺點大大限制了這些熒光探針的應用。
[0005] 為尋找更為靈敏、高效的熒光探針，Cy系列熒光染料越來越受到研究人員的青睞。 Cy熒光染料可以發近紅外的熒光，并具有一定環境敏感的性質，已廣泛地應用在生物大分 子，尤其是DNA的熒光檢測中。但是其在蛋白質的細胞熒光成像中的應用較少。在初期的 研究中發現，Cy5熒光染料（化合物C1，實例一）可以使多種細胞明顯著色，但是這種著色 沒有任何選擇性（附圖5)。如何化學修飾和連接Cy熒光染料，使得其熒光標記具有高度的 選擇性，也是科研人員亟待解決的難題。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術的不足，在已有的工作基礎上，本發明把a f腎上腺素能受體特異 性識別基團與Cy5熒光團進行連接，將熒光開關機制引入探針，使熒光性質得到有效的管 理，構建出針對a f腎上腺素能受體的高靈敏小分子近紅外熒光配體，并以此探針分子作 為工具藥用于a i-腎上腺素能受體的生物學和生理學特征的體內和體外研究，為a i-腎上 腺素能受體的研究提供更方便、更有效、全新的研究手段；具體為：本發明提供近紅外的具 有環境敏感熒光性質的a f腎上腺素能受體小分子熒光配體及其制備方法、光學性質、生 物活性、和受體藥理特征研究中的應用。該小分子熒光配體對Ct1-腎上腺素能受體具有高 選擇性和高靈敏度，可以作為工具藥去研究a f腎上腺素能受體的生物學和生理學特征。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0008] -種環境敏感型的a i-腎上腺素能受體近紅外熒光配體，具有下述結構通式： (I)0
[0010] 式中：&為6, 7-二甲氧基-2-(哌嗪-1-基）喹唑啉-4-氨，或1-(2-甲氧苯基） 哌嗪；X1為含或不含三唑環的長鏈連接基團；r2為不同取代基；χ2為鹵素離子。
[0011] 優選的，叫為1~6 32為碘或溴離子。
[0012] 更為優選的，Ii1等于1 $2為甲基；X為碘離子。
[0013] 更優選的，是下述化合物：
[0014]
[0015] 本發明所述化合物可用作a i-腎上腺素能受體的小分子熒光探針；
[0016] 本發明所述化合物可用作與a f腎上腺素能受體相關疾病的診斷和/檢測；優選 的，疾病為高血壓、前列腺肥大、前列腺癌。
[0017] 本發明所述化合物可用于篩選a f腎上腺素能受體相關疾病的藥物；優選的，所 述藥物為a f腎上腺素能受體拮抗劑或激動劑。
[0018] 本發明所述化合物可用于a i-腎上腺素能受體的細胞成像和/或流式檢測，在 此需要說明，所述應用方法不屬于疾病的診療方法，首先，細胞成像和/或流式檢測可用于 a f腎上腺素能受體拮抗劑或激動劑的篩選過程中；其次，用于生物體細胞時，所述細胞成 像和/或流式檢測的結果，無法直接說明機體是否患a i-腎上腺素能受體相關疾病，其作 為中間結果，需要進一步的與正常細胞比對并進一步的診斷才能確定生物體是否患病。
[0019] 有益結果：
[0020] (1)本發明探針分子的熒光性質隨著周圍環境的改變而發生變化，尤其是其熒光 會因周圍環境的極性減小或者黏度增大而顯著增強；
[0021] (2)當探針與a f腎上腺素能受體結合時熒光會大大增強，可以很容易地實現受 體蛋白的可視化，提高了信噪比，避免了繁瑣的洗滌步驟；
[0022] (3)本發明所述探針的熒光的波長可調范圍大，可進入近紅外區，能夠有效的避開 生物體系的自發熒光，從而極大提供了探針的靈敏性，避免干擾；
[0023] (4)本發明所述探針在兼顧靈敏性的同時，顯示出與a i-腎上腺素能受體極高的 親和力，對Ci1-腎上腺素能受體特異性較高，以該類熒光配體作為工具藥實現了 Ci1-腎上 腺素能受體細胞成像、亞細胞和細胞表達水平檢測等受體藥理學和生理學特征的研究。
【附圖說明】
[0024] 圖I. PTC-I在不同溶劑（A)以及DMSO與HEPES緩沖的混合溶液⑶中的熒光 發射光譜；PTC-I在不同體積甘油和水的混合溶液中的熒光強度和熒光壽命（C);不同濃度 PTC-I在水中的熒光壽命（D)。
[0025] 圖2. PTC-I (A)和熒光團Cl (B)對不同蛋白的熒光響應；多沙唑嗪淬滅PTC-I對 α 1-受體三種亞型蛋白特異性響應的熒光強度（C) ;PTC_1對α 1-受體轉染的HEK293細胞 特異性響應（D) ;PTC-1 的 ΗΕΚ293 細胞成像結果（E) : α 1Α-ΗΕΚ293 細胞（a，b)，a 1D-HEK293 細胞（c，d)，ΗΕΚ293 細胞（e)，a 1B-EGFP-HEK293 細胞（f，g);細胞以 PTC-l(300nM)孵育 (a，c，e，f)，細胞以PTC-I與多沙唑嗪混合溶液（300nm+3 μΜ)進行孵育（b，d，g)
[0026] 圖3. PTC-I的不同腫瘤細胞成像結果。a，PC-3細胞，PTC-I ;a'，PC-3細胞， PTC-l+doxazosin ;b，DU145 細胞，PTC-I ;b'，PC-3 細胞，PTC-l+doxazosin ;PTC-1 ;c，Hela 細胞，PTC-I ;d，ES-2 細胞，PTC-I ;e，A549 細胞，PTC-I ;f，MCF-7 細胞，PTC-I ;g，！fepG2 細 胞，PTC-I。
[0027] 圖4.流式細胞術測定α I-受體表達。A，α 1A-HEK293與HEK293細胞；B，PC_3與 Hela細胞。
[0028] 圖5. Cy熒光染料Cl (30nM)在不同細胞的成像結果。（A)HEK293細胞；(B)PC-3 細胞；（C) ES-2細胞.（a)明場；(b)紅色熒光；（c) a與b的疊合.Scale bar = 20 μ m。
【具體實施方式】
[0029] 下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制 本發明。
[0030] 實例一 ：PTC_1~3的合成
[0032] 反應試劑與條件：（a)3_碘代丙酸，乙腈，回流，48h，81 % ; (b)碘甲 烷，乙腈，回流，12h，86 % ; (c)鹽酸-N-(3-苯氨基-2-丙烯亞基）苯胺，AcOH/ AC2O, 120°C，4h ;吡啶 /AcOH, 120°C，4h ;30%兩步；（d)炔丙胺，EDCI, DMAP,二氯甲烷，匕 t.，6h，53 % ; (e)哌嗪，H2O, 100 °C，81 % ; (f)酰基氯，TEA,乙腈，lh，0 °C，62-75 % ; (g) NaN3, DMS0, 100 °C，6h, 35-88 %; (h)CuS04,抗壞血酸鈉，tBu0H/H20 = 2:1，50°C，lh，48. 9-67. 3%。
[0033] 中間體C3 :1 -(2-駿乙基）-2, 3, 3-二甲基-3H- Π 引噪-I-鵬鐵
[0034] 2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚（I. 0g, 6. 23mmol)和 3-碘丙酸（I. 86g, 9. 3mmol)溶于 15mL乙腈中，回流48小時后，降至室溫。旋干溶劑后，在超聲震蕩下，緩慢加入IOOmL乙酸 乙酯，有大量沉淀析出。過濾，20mL乙酸乙酯洗滌濾餅，干燥后等白色固體I. 8g，產率81 %。 熔點：181-183°c · 1HnmrgoomhzJMSO-CI6) : δ 12. 72 (s, 1H), 8· 01-7. 98 (m, 1H), 7· 85-7. 83 (m ,1Η), 7. 62-7. 60 (m, 2Η), 4. 67 (t, 2Η, J = 7. 0Hz), 3. 00 (t, 2Η, J = 7. 0Hz), 2. 86 (s, 3Η), 1. 53 (s, 6Η). 13CNMRdOOMHz, DMSO-(I6) : δ 198. 4, 172. Ο, 142. 2, 141. 3, 129. 8, 129. 4, 124. Ο, 116. 0, 54. 7, 44. 0, 31. 6, 22. 4, 14. 9· ESI-MS:m/z[M-I ]calcd for C14HlsN202+232. I, found232. 4。
[0035] 中間體C4 :1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚-I-碘鑰
[0036] 2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚（2. Og, 12. 5mmol)和碘甲烷（2. 3g, 16. 3mmol)溶于 20m