專利名稱：一種基于雄激素受體體外受體-配體結合效應的環境類雄激素的elisa定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及環境類雄激素檢測方法，具體涉及一種基于雄激素受體體外受體-配
體結合效應的環境類雄激素的ELISA定量檢測方法。
背景技術：
近年來，隨著工業污染加劇，許多人造工業化學物質及農藥的多種化學成分具有 類激素或抗體內激素的作用，可能干擾人類及野生生物體內分泌正常功能，它們潛在的威 脅包括導致人類和動物的多個系統如內分泌紊亂、生長發育異常、出生缺陷、生殖能力下 降、腫瘤發生增加等問題，是當前毒理學研究熱點之一。 環境類雄激素(environmental antiandrogen， EA)就是這樣一類重要的環境內 分泌干擾物質，他們可模擬體內天然的雄激素，與雄激素受體(androgenrec印tor， AR)競 爭性結合，阻止體內雄激素與AR的結合，充當AR拮抗劑，從而抑制雄激素活性，發揮類雄 激素作用，動物胚胎期暴露可導致生殖器官發育不全或缺失(特別是副睪)、外生殖器畸形 (尿道下裂)、隱睪、肛門與生殖器距離縮短等生殖毒性和畸形。目前報道的EA主要涉及 一些非甾體藥物如氟他胺(flutamide， FLU)、非那雄胺(finasteride, FIN)，農藥中的殺蟲 劑、殺菌劑和除草劑及其代謝產物，如合成除蟲菊酯類(pyrethroids) 、 DDT的代謝產物p， p' -DDE、甲氧滴滴涕(methoxychlor)、殺菌利(procymidone)、烯菌酮(vinclozolin， V)及 其代謝產物M工和i^等。 傳統的檢測方法中多以GC和GC-MS法作為檢測EA的標準方法。但由于EA通常以 痕量混合物的形式存在，且化學性質差異很大，采用傳統的萃取富集、高效液相色譜/質譜 /氣相色譜等方法分離出單一成分并測定含量，其分析手段復雜、操作繁瑣、費時費力、設備 昂貴、需要專門高級訓練，并且很難達到所有痕量成分的完全解析。且環境中存在著大量化 學物，截止到2009年11月24日，在化學文摘社(Chemical Abstracts Service, CAS)登記 的化學物質達51 045 390種，面對如此多的化學物，傳統的試驗方法已無法滿足需求，所 以必須探索高通量篩選方法。1998年美國美國環保局(U.S. EPA)推出《環境內分泌干擾物 篩檢程序》，提出分層式篩選方法，包括分類(sorting)、優先權設定(prioritysetting)、第 一級篩選0\S)及第二級檢測(T2S)四階段其中包括LS階段的3項體外和5項體內試驗 以及T2S階段的5項活體動物暴露實驗。 但是如此完善的篩檢程序，是以犧牲無數受試動物生命為代價的，并且需要耗費 大量的人力物力和時間。因此，許多學者致力于探索更快速、便捷與完善的高通量環境激素 測評體系，這些嘗試包括無細胞(cell-free)和完整細胞(wholecell)受體結合試驗、雄 激素依賴細胞增殖試驗、雄激素依賴基因轉錄活化試驗、重組基因酵母測評體系、GFP-AR免 疫細胞化學方法等。但是，由于這些方法本身的局限，如細胞培養的不穩定性、細胞不能精 確定量等，使得這些方法通量低、周期長、系統誤差較大，而且樣品中的EA也可能被細胞降 解，準確性、穩定性和靈敏度不理想。
已有的研究表明，AR是一種配體依賴型的反式轉錄調節蛋白，屬于核受體超家族 成員。AR基因一般由4個結構域組成低保守的氨基端結構域(N-Termi皿sdomain， NTD)、 高保守的DNA結合結構域(DNA binding domin，DBD)、鉸鏈區(flexible hinge)以及高保 守的羧基端配體結合結構域(ligand bindingdomain， LBD)，見附圖1。其中DBD區能與靶 基因上雄激素反應元件(androgenresponse element, ARE)特異結合；LBD區結合激素，AR 一旦與雄激素結合，就會激活變構形成二聚體，然后與ARE特異性結合，剌激靶基因轉錄， 從而表現出各種生理效應。ARE的核心序列為5'-GGAACAnnnTGTATC-3' (n為任意核苷酸)。
環境類雄激素EA就是以與內源雄激素如睪酮(Testosterone, T)及雙氫睪酮 (Dihydrotestosterone，DHT)類似的形式與AR結合，并和內源雄激素一樣通過AR介導而產 生相應的病理性效應。目前基于受體配體結合的篩選方法，既可以反映EA的結合量，又能 綜合反映EA的類雄激素樣累加毒性當量(TEQ)，且易于實現高通量，是最近幾年EA高通量 篩選和監測的新方向。Gaido等(GaidoK W， etal. Toxicol Appl Pharmacol, 1997， 143 (1): 205-212)采用重組酵母測評體系評價環境類雄激素誘導的酵母細胞內結合效應，但此方法 檢出在y M nM水平，靈敏度和準確性尚不理想。 綜上所述，對于環境中為數眾多、增長迅速的化合物中的環境類雄激素來說，目前 的環境污染物分析技術的進展還遠遠不能滿足監測要求，發展快速、高通量、靈敏度高且重 復性好的廉價篩選技術是一個亟待解決的問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種廉價、快速、高通量的基于雄激素受體體外受體_配體 結合效應的環境類雄激素的ELISA定量檢測方法。 本發明利用配體-受體生物學激活效應的高效、特異性，以及生物素-親和素的放
大效應和辣根過氧化酶催化底物顯色的靈敏性，建立痕量環境類雄激素(EA)累加毒性當 量(TEQ)的快速定量檢測技術，實現痕量環境類雄激素TEQ的廉價、快速、高通量監測。
本發明的這一目的是通過以下的技術方案實現的即痕量環境類雄激素(EA) 作為配體與雄激素受體(AR)結合后，受體變構二聚化，識別并結合含有雄激素反應元件 (ARE)核心序列5' -GGAACAnnnTGTATC-3' (n為任意核苷酸)的DNA雙鏈探針，此DNA探 針正鏈的5'端用生物素(Biotin)標記，形成生物素DNA探針-AR-EA復合物(Biotin-DNA AR-EA probe complex,也即BARC)，采用AR特異的單克隆抗體吸附并分離BARC，洗去未結 合的DNA探針，然后針對結合的BARC中生物素標記的DNA采用鏈親和素標記的辣根過氧化 物酶進行ELISA檢測，從而評估樣本中EA的生物學效應。 因此，本發明涉及的一種基于雄激素受體體外受體-配體結合效應的環境類雄激 素的ELISA定量檢測方法，包括以下步驟 (1)設計合成5'端用生物素標記的DNA探針正鏈，其全序列中含有雄激素反應元 件核心序列5' -GGAACAnnnTGTATC-3'，其中n為任意核苷酸； (2)合成步驟(1)所述探針的堿基互補連，等量加入(1)所述探針，在退火緩沖液 中退火，形成5'端用生物素標記的DNA雙鏈探針； (3)將雄激素受體特異的鼠源性單克隆抗體McAb加入到羊抗鼠IgG包被的磁珠 里，洗滌，得到McAb-磁珠固相載體；
(4)將含環境類雄激素的待檢樣品與雄激素受體在結合緩沖液中4t:振搖孵育1 小時，然后37t:孵育30分鐘，使環境類雄激素與雄激素受體結合，受體發生變構，暴露受體 DNA結合結構域，形成雄激素受體_環境類雄激素復合物； (5)向步驟(4)復合物中加入步驟(2)所述5'端用生物素標記的DNA雙鏈探針， 37t:反應10分鐘，形成生物素DNA探針-雄激素受體-環境類雄激素復合物；
(6)將步驟(5)所得生物素DNA探針-雄激素受體_環境類雄激素復合物溶液中 加入到步驟(3)所述的McAb-磁珠固相載體，形成雄激素受體-McAb-磁珠IgG復合物，用 磁力架吸附收集此復合物，洗去未結合的探針； (7)向步驟(6)所述的復合物中加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶，37t:孵育 0. 5-1小時，使DNA探針上標記的生物素與鏈親和素特異性結合，磁力架收集磁珠復合物， 洗去未結合的酶； (8)向步驟(7)磁珠復合物中加入辣根過氧化物酶的催化底物四甲基聯苯胺和受 氫體過氧化氫，37t:孵育10-30分鐘，催化底物顯色； (9)向步驟(8)已顯色的混合液中加入含有硫酸的終止液終止顯色反應，磁力架 吸附磁珠，收集上清； (10)將步驟(9)收集的上清加入到聚苯乙烯酶標板，也即ELISA板，在ELISA檢 測儀上，于450nm處，測定各孔吸光度值，與以睪酮或雙氫睪酮為標準品所作的標準曲線比 對，確定待測樣品中類雄激素物質的累計當量。 本技術的優點在于(l)與傳統的GC和GC-MS法相比，本技術沒有鑒定復雜混合 物的困難，由于模擬激素生物學過程，既可以反映EA的結合量，又能反映EA的綜合類雄激 素樣TEQ活性；GC及GC-MS分析操作繁瑣、技術要求高、成本昂貴、費時費力。(2)與基因轉 錄活化、細胞增殖實驗相比，本技術無長達2周的細胞培養周期，在l-2天內能出具結果、試 驗周期極短。(3)與現有受體配體結合檢測技術相比，本技術通過AR的體外受體-配體結 合效應并通過生物素_親和素的放大效應，使得靈敏度提高高，達到甚至超過GC和GC-MS 分析化學方法，檢測達到pM級。(4)本發明技術操作簡便、快捷，技術平臺要求不高，普通實 驗室即可開展，可廣泛用于食品、環境檢測等領域。
附圖1為雄激素受體AR結構示意圖； 附圖2顯示了各種雄激素/類雄激素與AR的結合劑量_效應曲線(結合能力)。
具體實施例方式
下面的實施例意在說明實施本發明的現已知的一個最佳的實施方案，但是不應該 認為本發明局限于這些實施例。 實施例1設計合成能與AR特異性結合的生物素標記的DNA探針 設計合成5'端用生物素標記的DNA探針正鏈，其全序列中含有雄激素反應元件核
心序列5' -GGAACAnnnTGTATC-3'，其中n為任意核苷酸，其全序列為5' -Biotin-AGACC
心序列周圍的核苷酸可作調整，用SEQ Nol表示；合成其互補鏈5' -ACAACAGATTTGATACAA序列由上海生物工程有限公司標記和合成。 實施例2設計合成能與AR特異性結合的生物素標記的DNA探針 設計合成5'端用生物素標記的DNA探針正鏈，其全序列中含有雄激素反應元件
核心序列5' -GGAACAnnnTGTATC-3'，其中n為任意核苷酸，其全序列為5' -Biotin-AGA
核心序列周圍的核苷酸可作調整，用SEQ No3表示；合成其互補鏈5' -ACAACAGATTTGATA
示；序列由上海生物工程有限公司標記和合成。 實施例3將兩條互補的單鏈退火形成DNA雙鏈探針用退火緩沖液(10mM Tris-HCl， 50mM NaCl， lmM EDTA，pH = 8. 0)溶解實施例1所
述SEQ Nol和SEQ No2，使其終濃度為20 100umol/L。將二條鏈等摩爾混合，于94。C保溫
5分鐘后、45t:保溫5分鐘，冷卻至室溫，-2(rC保存備用。 實施例4磁珠固相載體預處理及與AR單克隆抗體McAb結合 用300 ii L含5g/L牛血清白蛋白和lmg/ml鮭魚精DNA的PBS預處理包被有二
抗-羊抗鼠IgG的免疫磁株，于fC在一個旋轉平臺上30轉/分輕輕振搖6 12小時，以
減少非特異性吸附。用磁力架收集磁珠，再用含有5g/L BSA冷的PBS洗滌磁珠3次，備用。
然后將l : 300稀釋的鼠源性AR單克隆抗體McAb與預處理的免疫磁珠于室溫下輕微搖動
1 3小時，形成磁珠-二抗-McAb固相載體。磁力架收集此固相載體，洗滌3次，備用。 實施例5痕量EA與AR的體外特異結合體系樣品中EA與AR的結合在下列結合緩沖液體系和條件進行50mMTris-HCl， lmM EDTA，500mM KC1， 2mM二硫赤蘚糖醇(DTT) ， 2mg/ml牛血清白蛋白(BSA) ， 5%甘油，結合緩沖 液pH 7.6。采用100iiL體系，4t:孵育數小時，移至37t:孵育30分鐘。
實施例6 EA與AR的結合試驗流程 終濃度為10nM的AR 50 y L與50 y L系列濃度的雄激素/類雄激素，如睪酮、雙氫 睪酮、氟他胺、烯菌酮等(終濃度從1. OX 10—14 1. OX 10—6M)，在實施例5所述結合緩沖液 中4t:孵育1小時，移至37t:孵育30分鐘，促進AR二聚體化變構，暴露受體DNA結合結構 域，加入5ng實施例3所述的DNA雙鏈探針孵育10分鐘，形成生物素DNA探針-AR-EA復合 物，也即BARC。不加雄激素作為空白對照，所有受試樣本均做復孔。將此BARC加入實施例 4所述的磁珠_ 二抗-McAb固相載體，輕輕混勻，室溫，在一個旋轉平臺上30轉/分輕搖1 小時，即得BARC-McAb-磁珠IgG復合物，用磁力架吸附分離此復合物，去上清，洗去游離的 探針。 實施例7 結合探針的親和素放大ELISA檢測 向實施例6收集的磁珠復合物中，加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶，37t:孵 育0. 5 1小時，使DNA探針上標記的生物素與鏈親和素特異性結合，形成復合物，向復合 物中加入辣根過氧化物酶的催化底物四甲基聯苯胺TMB和受氫體H202， 37t:孵育10 30 分鐘，催化TMB顯色，然后加入含有硫酸的終止液終止顯色反應，磁力架收集已顯色上清 液。將此上清液加入到聚苯乙烯酶標板，也即ELISA板，將此ELISA板在ELISA檢測儀上， 于450nm處，測定各孔吸光度值，也即OD值，與以系列濃度雙氫睪酮(DHT)或睪酮(T)為標準品所作的標準曲線比對，確定待測樣品中類雄激素物質的相對含量及累計當量。系列標 準品的濃度可分為1 X 10—12、 1 X 10—"、 1 X 10—1Q、 1 X 10—9、 1 X 10—8、 1 X 10—7、 1 X 10—6、 1 X 10—5M。
實施例8觀察不同雄激素/類雄激素與AR的結合能力及檢測體系對痕量EA的 檢測能力 配制不同濃度的雄激素和類雄激素標準品，包括睪酮(T)、雙氫睪酮(DHT)、羥基 氟他胺(Hydroxyflutamide, OH-FLU)、孕激素(Progesterone, Pro) 、 p， p' -DDE等，在實施 例6 7的結合體系中，觀察不同雄激素/類雄激素與AR的結合能力，并測定測定檢測體 系的靈敏度(檢測下限)和準確性(回收率)。結果顯示，結合能力順序為DHT " T > Pro > 0H-FLU > p，p' -DDE，見附圖2。以傳統細胞增殖實驗和GC/MS分析結果為對照方法，進 行比較。本技術可在l-2天內出具定量結果，靈敏度可達pM級，以傳統方法相比，本方法具 有快速、高效、高通量以及準確性、靈敏度高的優點。
與本發明有關的核苷酸序列 〈110〉中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院 〈120〉 一種基于雄激素受體體外受體_配體結合效應的環境類雄激素的ELISA定
量檢測方法 〈160>4 〈170〉 〈210>1 〈211>75 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈221〉結合探針正鏈 〈223〉根據雄激素反應元件而設計，含有兩個雄激素反應元件，其5'端用生物素
標記，作為結合雄激素受體的特異序列。 〈400〉 1
TGTATCAAATCTGTTGT-3' 〈210>2 〈211>75 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221〉結合探針互補鏈 〈223〉為SEQ Nol的互補鏈 〈400>2
GAGTAGGTCT-3'
〈210>3
〈211>75 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221〉結合探針正鏈 〈223〉根據雄激素反應元件而設計，含有兩個雄激素反應元件，其5'端用生物素
標記，作為結合雄激素受體的特異序列。
〈400>3
TGTATCACATCTGCCTA-3' 〈210>4 〈211>75 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221〉結合探針互補鏈 〈223〉為SEQ No3的互補鏈 〈400>4
GAGTAGTGCC-3'
權利要求
一種基于雄激素受體體外受體-配體結合效應的環境類雄激素的ELISA定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)設計合成5′端用生物素標記的DNA探針正鏈，其全序列中含有雄激素反應元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，其中n為任意核苷酸；(2)合成步驟(1)所述探針的堿基互補連，等量加入(1)所述探針，在退火緩沖液中退火，形成5’端用生物素標記的DNA雙鏈探針；(3)將雄激素受體特異的鼠源性單克隆抗體McAb加入到羊抗鼠IgG包被的磁珠里，洗滌，得到McAb-磁珠固相載體；(4)將含環境類雄激素的待檢樣品與雄激素受體在結合緩沖液中4℃振搖孵育1小時，然后37℃孵育30分鐘，使環境類雄激素與雄激素受體結合，受體發生變構，暴露受體DNA結合結構域，形成雄激素受體-環境類雄激素復合物；(5)向步驟(4)復合物中加入步驟(2)所述5′端用生物素標記的DNA雙鏈探針，37℃反應10分鐘，形成生物素DNA探針-雄激素受體-環境類雄激素復合物；(6)將步驟(5)所得生物素DNA探針-雄激素受體-環境類雄激素復合物溶液中加入到步驟(3)所述的McAb-磁珠固相載體，形成雄激素受體-McAb-磁珠IgG復合物，用磁力架吸附收集此復合物，洗去未結合的探針；(7)向步驟(6)所述的復合物中加入鏈親和素標記的辣根過氧化物酶，37℃孵育0.5-1小時，使DNA探針上標記的生物素與鏈親和素特異性結合，磁力架收集磁珠復合物，洗去未結合的酶；(8)向步驟(7)磁珠復合物中加入辣根過氧化物酶的催化底物四甲基聯苯胺和受氫體過氧化氫，37℃孵育10-30分鐘，催化底物顯色；(9)向步驟(8)已顯色的混合液中加入含有硫酸的終止液終止顯色反應，磁力架吸附磁珠，收集上清；(10)將步驟(9)收集的上清加入到聚苯乙烯酶標板，也即ELISA板，在ELISA檢測儀上，于450nm處，測定各孔吸光度值，與以睪酮或雙氫睪酮為標準品所作的標準曲線比對，確定待測樣品中類雄激素物質的累計當量。
2. 根據權利要求1所述的一種基于雄激素受體體外受體_配體結合效應的環境類雄 激素的ELISA定量檢測方法，其特征在于步驟(4)中的結合緩沖液每升由1.2 12.5g Tris-HCl，O. 1 1. 5g EDTA，7. 5 35g KCl，O. 1 2g 二硫赤蘚糖醇，1 5g牛血清白蛋 白，50 100ml甘油及余量為去離子水組成。
3. 根據權利要求l所述的一種基于雄激素受體體外受體-配體結合效應的環境類雄激 素的ELISA定量檢測方法，其特征是5'端用生物素標記的DNA探針正鏈的核苷酸序列為 SEQ Nol或SEQ No3。
全文摘要
本發明涉及一種基于雄激素受體體外受體-配體結合效應的環境類雄激素的ELISA定量檢測方法。方法包括將雄激素受體與環境類雄激素結合后，雄激素受體二聚化變構，結合含有雄激素反應元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′的生物素標記的DNA探針，形成生物素DNA探針-雄激素受體-環境類雄激素復合物，并采用雄激素受體單克隆抗體對其吸附分離，再用鏈親和素標記的辣根過氧化物酶進行ELISA檢測，從而評估樣本中類雄激素的效應和含量。本發明方法操作簡便、快捷，靈敏度高，檢測限可達pM級。可廣泛用于食品、環境檢測等領域。
文檔編號G01N33/577GK101738477SQ20091019191
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者毛青, 王莎莎, 章容, 譚文婷, 鄧國宏 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院