一種生物除鐵除錳功能菌的制作方法

專利名稱：：一種生物除鐵除錳功能菌的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物。技術背景水體中鐵的去除工藝較為成熟，單純具有除鐵功能的工程菌也比較多，但鐵和錳是地殼中含量豐富的金屬元素，僅將鐵去除遠遠不能滿足現有的水處理標準。普通水體中錳離子的濃度為0.1lmg/L，而厭氧地下水中溶解性的錳離子濃度可高達7-9mg/L。可溶性錳經充氧曝氣能夠生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。Mn02是高度不可溶物質(5—Mn02的溶解度kso僅為1(T56)，呈深黑色，可導致供飲用的地下水出現明顯的色度；因此飲用水中的錳必須去除。我國規定飲用水中錳離子的最高濃度為0.1mg/L，而歐盟已將飲用水中錳離子的最高濃度確定為0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴隨著錳離子的氧化、沉淀以及不溶性氧化產物的過濾分離。錳離子發生的非生物氧化反應如下—4她(n)]=^她01)]+fc[她(ii)][她cv]表明Mn(II)的氧化伴隨著MnOx的自催化反應，這種自催化作用在飲用水錳處理工藝中較為重要。Mn(II)非生物氧化由氧作電子供體，通常在pH值大于9的條件下完成，低于9的pH條件下氧化反應速度極慢。絕大多數的飲用水pH在6~8之間，這種pH條件下Mn(II)不會發生氧化反應；因此飲用水中的錳不能通過簡單的曝氣和沉淀法去除。若加入化學藥劑(如KMn04和C102)雖然除錳效果較為理想，但增加了工藝運行費用、反應殘留物和生成的副產物，引起二次污染。生物氧化除錳具有良好的應用前景，但是目前生物氧化除錳主要利用自然選擇建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除錳效果差，而且水處理過濾速度慢、不能超過10m/h。現有水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化和啟動時間長；一旦工程菌群遭到破壞(中毒等原因導致工程菌死亡)其恢復周期長，在此期間出水中錳含量劇增、出水質量難以保證，致使該水處理設施不能正常運轉，嚴重的將威脅人民群眾的正常生活和生態環境。
發明內容本發明的目的是為了解決目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化、啟動時間長和工程菌群遭到破壞后恢復周期長的問題，而提供的一種生物除鐵除錳功能菌。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^eoto"m'wwsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239;生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z^^oZ)""en'wmsp.)為好氧菌，長為1.52pm，寬為0.8~l.l|am，短桿狀細胞，兩端鈍圓，多個細菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團，有共同的莢膜；在培養基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C77o^o6。"m'Mmsp.)具有能量貯存顆粒，無芽胞，N，N，N，，N，-四甲基對苯二胺(TMPD)染色為陽性。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C770^o^"m'wmsp.)能在pH值為7~10的環境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2，eok^en'謂sp.)有脂質顆粒聚(3-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質顆粒PHB和異染顆粒Pdy-P都屬于能量貯存顆粒，因此生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C720^o^"m'簡sp.)可以適應低溫、貧營養生長環境，具有惡劣環境適應能力強的優點。本發明生物除鐵除錳功能菌MSB-4通過16SrDNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是金黃桿菌屬的C770^eok"eWMwsp.TM3-8，同源性為99%,因此被命名為C7zo^eo6acfen'wwsp.。本發明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(0，eo^cm'謂sp.)不但能去除水中的Mr^+，還能去除水中的Fe2、Mi^+去除率高于94.44%，Fe2+去除率高于90.13%。本發明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/o^o^cten'謂sp.)的生化能力強、除錳效果好，可以直接投入使用，不僅縮短了水處理除錳生物濾池的建立時間，也可加快過濾速度，并且縮短了工程菌群遭到破壞后的恢復周期，可以在短暫的34小時內恢復水處理設施正常運行，保證了出水的質量。C7zo^eo6(3cfen.w附sp.屬于金黃桿菌屬(G/w3^e06a"en.wm)i呆藏于中SH斂生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239。圖1是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C720^o&c欣/蘭sp.)的原子力顯微鏡圖片；圖2是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C770^o6fl"en'調sp.)的原子力顯微鏡圖片；圖3是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/z，eo^cfen'謂sp.)中脂質顆粒染色后觀察圖；圖4是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C72，eo^"m',sp.)中異染顆粒染色后觀察圖；圖5是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z，eo^"en'訓sp.)去除水中Mn2+的時間曲線圖；圖6是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^06a"eWw/wsp.)去除水中Fe"的時間曲線圖。具體實施方式具體實施方式一本實施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^oZ^"m'wwsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239;生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^oto"m'畫sp.)為好氧菌，長為1.52pm，寬為0.81.1pm，短桿狀細胞，兩端鈍圓(如圖1和圖2所示)，多個細菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團，有共同的莢膜；在培養基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^o&"m'"wsp.)具有能量貯存顆粒，無芽胞，N,N,N，，N，—四甲基對苯二胺(TMPD)染色為陽性。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/7o^eokc^7'Mwsp.)能在pH值為7~10的環境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^o^cten'wmsp.)趨向于形成35個或更多的細胞組成的鏈。具體實施方式二本實施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C72o^ok^m'騰sp.)是從遼寧省沈陽市張士生物除錳水廠的生物除錳濾池曝氣池壁取泥中篩選得到的。篩選用1L培養基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，0.1gMnSO4.H2O，0,lgK2HPO4，0.2gMgS04'7H20，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，0.1g(NH4)2CO3，O.OlgFeS04'7H20和余量的蒸餾水制成；然后滅菌。本實施方式采用平板劃線與平板涂布法相結合進行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ，DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)對分離所得菌種進行初篩。本實施方式采用TMPD法的原理是N，N,N',N'-四甲基對苯二胺(N，N，N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可與四價錳反應生成藍色物質WursterBlue,利用分光光度法通過測WursterBlue在420nm處的OD值可推知菌落具有,2+氧化能力的強弱(菌落無顏色變化的為陰性、無生物除錳功能)。本實施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(CV^eoZ)""m'"wsp.)16SrDNA測序工作由生物工程公司完成；其中PCR擴增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，。本實施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^^^a"en'wmsp.)16SrDNA序列如SEQIDNO.l所示。本實施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^oZ)a"en'Mmsp.)生理生化分析結果如表l所示。表1生物除鐵除錳功能菌MSB-4生理生化分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>酸。硝酸鹽還原試驗+具有硝酸還原鹽能力氧化酶試驗+可以和細胞色素a、b、c構成氧化酶系的氧化酶產n引哚試驗一不具有能分解色氨酸使之形成吲哚的色氨酸酶明膠液化試驗—沒有分解蛋白質的能力產硫化氫試驗—不能分解含硫有機物產生硫化氫PH值試驗pH7~10(pH8~9時生長最好)適于在堿性環境中生長生長溫度試驗2037°C一般溫度下都可以正常生長需氧性的測定上部生長屬于好氧型的細菌生理生化實驗結果表明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7o^ok^m'訓sp.)是好氧菌，適于在偏堿性水環境生長；具淀粉酶和氧化酶；不具有脂肪酶、色氨酸酶、脫氨酶；沒有發酵葡萄糖產生乙酰四基甲醇的能力；不能在糖代謝過程中分解葡萄糖產生丙酮酸；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^eo^c&n'wmsp.)有脂質顆粒聚P-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質顆粒PHB和異染顆粒Poly-P都屬于貯存顆粒。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2，eoZ^ten'謂sp.)中脂質顆粒染色后觀察圖如圖3所示，生物除鐵除錳功能菌MSB-4(02o^ok"m'iw7sp.)中異染顆粒染色后觀察圖如圖4所示。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^o6acten'wmsp.)的發酵上清液具有較高的除錳活性，試驗表明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zrj^M""m'謂sp.)能夠分泌大量的除錳胞外蛋白酶。接菌培養生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7w7"o6""en'wwsp.)，液體培養液pH值為7.5，在12'C的條件下培養48h，然后向培養液中加入Mr+溶液使培養液中Mi^+的濃度為5.6mg/L，液體培養液中Mi產的濃度隨時間的變化曲線如圖5所示；在1224h期間，Mr產去除率迅速升高，達80%。，直到48h后趨于穩定，Mn"去除率達到94.44%。接菌培養生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^o^"m'訓sp.)，液體培養液pH值為7.5，在12'C的條件下培養48h，然后向培養液中加入F^+溶液使培養液中Ff的濃度為，14mg/L，液體培養液中F^+的濃度隨時間的變化曲線如圖6所示；在12h內，Fe"去除率迅速增高，去除率高達81%，Fe"濃度由14mg/L降至2.66mg/L。24h后，去除率趨于穩定，Fe"去除率達到90.13%。實驗證明，生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z，eoZ^"m'謂sp.)屬具除鐵除錳功能的好氧菌種，具異染顆粒、類脂粒，易形成菌膠團，對外界不良環境具有較強抗性。MSB-4具有較高的鐵錳去除率，對F^+去除率高達90.13%，Mn2+去除率高達94.44%。<110>哈爾濱工業大學<120>—種生物除鐵除錳功能菌<160>3<210>1<211>1515<212>DNA<213>生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^o6a"en'ww平)<220><223>生物除鐵除錳功能菌MSB-416SrDNA基因序列<400>1tgatccagccgcaccttccggtacggctaccttgttacgscttagcccta60gttacttgttttaccctaggcagctcctgttacggtcaccgacttcaggtaccccaasct120tccatggcttgacgggcggtgtgtaca鄉cccggg犯cgtattcaccgcatcatggctg180atatgcgattactagcgattccagcttcat卿gtcgagttgcagactccaatccgaact240g卿ccggctttcgagattcgcatcctatcgctaggt已gctgccctctgtaccggccatt300gt3ttacgtgtgtggccc犯ggcgt已鄉gccgtgatgatttgacgtcatccccaccttc360CtCtCtELCttgcgtaggcagtctcactagagtccccaeictgaatgatggcaactagtgac420郷ggttgcgctcgttgcaggsctt幼cct幼C3CCtCgLCggcacgsgctgscgac^cc480atgcagcacctccga^gaaaagtctatttctaaaxxtgtc540taagccttggtaaggttcctcgcgtatcatcgaatta犯ccacataatccaccgcttgtg600cgggcccccgtcaattcctttgagtttcattcttgcg犯cgtactccccaggtggct犯c660ttatcactttcgcttagtctctg犯tccga￡Lg￡LCCC￡Laa3acgagttagcatcgtttacg720gcgtgg已ctacc已gggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgtccatcagcgtca780agtgacctgccttcgcaattggtgttctaagtaatatctatgcatttcac840cgctacactaCtt已ttCC3gccacttctactttactca^gacctgcagtatc犯tggcag900tttcatagtta已gctatg3gatttcaccactgacttacagatccgcctacgg3CCCttt3960atccggat犯cgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggag1020ttagccggtgcttattcgtatagtaccttcagctttccacacgtgga犯ggtttatccct1080agtttacaacccatagggccgtcgtccttxacgcgg抓ggctgg已tc觀1140gctctcacccattgtccaatattcctxactgctgcctcccgtaggagtctggtccgtgtc1200tcagtaccagtgtgggggatcaccctctcaggccccctaaagatcactgacttggtaggc1260cgttaccctaccaactatctaatcttgcgcgtgcccatctctatccaccggagttttC331320ta犯已aacgatgccgtttcttatattatggggtattaatcttcctttcgaaaggctatcc1380CCCtg3t犯3ggc鄉ttgcacacgtgttccgcacccgtacgccgctctctctattccga1440agaataaataccgctcggcttgcatgtgttaggcctcccgctagcgttcatcctgagcca1500ggatcaaactctaat1515<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.coli16SrRNA基因8~20bp設計PCR擴增正向引物BSF8/20序列<400>2agagtttgatcctggctcag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.coli16SrRNA基因1520~1541bp設計PCR擴增正向引物BSR1541/20序列。<400>3aaggaggtgatccagccgca20權利要求1、一種生物除鐵除錳功能菌，其特征在于生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)為好氧菌，長為1.5～2μm，寬為0.8～1.1μm，短桿狀細胞，兩端鈍圓，多個細菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團，有共同的莢膜；在培養基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)具有能量貯存顆粒，無芽胞，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。2、根據權利要求1所述的一種生物除鐵除錳功能菌，其特征在于生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2o^ok/"m'wwsp.)能在pH值為710的環境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。全文摘要一種生物除鐵除錳功能菌，它涉及一種微生物。它解決了目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化、啟動時間長和工程菌群遭到破壞后恢復周期長的問題。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2239；菌株MSB-4為好氧菌，長為1.5～2μm，寬為0.8～1.1μm，短桿狀細胞，兩端鈍圓；在培養基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形；菌株MSB-4具異染顆粒和類脂粒，無芽胞，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。本發明生物除鐵除錳功能菌MSB-4具有去除水中Mn²⁺、Fe²⁺的能力，Mn²⁺去除率高達94.44％，Fe²⁺去除率高達90.13％。文檔編號C02F1/62GK101230326SQ20081006381公開日2008年7月30日申請日期2008年1月7日優先權日2008年1月7日發明者杰張,冬李,焱趙申請人:哈爾濱工業大學