一種生物除錳功能菌的制作方法

專利名稱：：一種生物除錳功能菌的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物。技術背景錳是地殼中含量豐富的金屬元素，普通水體中錳離子的濃度為0.1lmg/L，而厭氧地下水中溶解性的錳離子濃度可高達7~9mg/L。可溶性錳經充氧曝氣能夠生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。Mn02是高度不可溶物質(5—Mn02的溶解度kso僅為10—56)，呈深黑色，可導致供飲用的地下水出現明顯的色度；因此飲用水中的錳必須去除。我國規定飲用水中錳離子的最高濃度為0.1mg/L,而歐盟已將飲用水中錳離子的最高濃度確定為0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴隨著錳離子的氧化、沉淀以及不溶性氧化產物的過濾分離。錳離子發生的非生物氧化反應如下表明Mn(II)的氧化伴隨著MnOx的自催化反應，這種自催化作用在飲用水錳處理工藝中較為重要。Mn(II)非生物氧化由氧作電子供體，通常在pH值大于9的條件下完成，低于9的pH條件下氧化反應速度極慢。絕大多數的飲用水pH在6~8之間，這種pH條件下Mn(II)不會發生氧化反應；因此飲用水中的錳不能通過簡單的曝氣和沉淀法去除。若加入化學藥劑(如KMn04和C102)雖然除錳效果較為理想，但增加了工藝運行費用、反應殘留物和生成的副產物，引起二次污染。生物氧化除錳具有良好的應用前景，但是目前生物氧化除錳主要利用自然選擇建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除錳效果差，而且水處理過濾速度慢、不能超過10m/h。現有水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化和啟動時間長；一旦工程菌群遭到破壞(中毒等原因導致工程菌死亡)其恢復周期長，在此期間出水中錳含量劇增、出水質量難以保證，致使該水處理設施不能正常運轉，嚴重的將威脅人民群眾的正常生活和生態環境。
發明內容本發明的目的是為了解決目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差，過濾速度慢；水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化、啟動時間長和工程菌群遭到破壞后恢復周期長的問題，而提供的一種生物除錳功能菌。生物除錳功能菌MB4C&c/gwotoc&Wwwsp.)屬于微小桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2237;生物除錳功能菌MB4C&c/gwo^"er/wmsp.)為革蘭氏陽性微好氧菌，短桿菌，個體小，長為l~1.5pm，寬為0.50.8pm，細胞兩端鈍圓；在培養基上形成棕色菌落，不透明，中心顏色較深，四周顏色較淺，菌落為圓形；生物除錳功能菌MB4(五x/gwo6ac妙/wwsp.)具有能源貯存顆粒，無芽胞和莢膜，N,N,N',N，-四甲基對苯二胺(N,N，N，,N，-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽性。生物除錳功能菌MB4(五;a'gwoZ^"en^wsp.)能在pH值為410的環境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除錳功能菌MB40&c/gMo6a"eW^7sp.)細菌體內有類脂顆粒聚(3-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，PHB和Poly-P都屬于細菌細胞內的能源貯存顆粒，因此生物除錳功能菌MB4CEx/gMOk^^7'Mmsp.)可以更好的適應低溫、貧營養生長環境，具有惡劣環境適應能力強的優點。本發明生物除錳功能菌MB4通過16SrDNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是微小桿菌屬的Ex/gwo6"cfeWwwacetylicum(GenbankDQ019167.1)，同源性為99%，因此被命名為五;dgwotecfen'wwsp.。本發明生物除錳功能菌MB4(^n'gMo^c^/簡sp.)具有去除水中M^+的能力，Mi產去除率高于9iy。。本發明生物除錳功能菌MB4(iBc/^o6a^n'聽sp.)的生化能力強、除錳效果好，可以直接投入使用，不僅縮短了水處理除錳生物濾池的建立時間，也可加快過濾速度，并且縮短了工程菌群遭到破壞后的恢復周期，可以在短暫的3~4小時內恢復水處理設施正常運行，保證了出水的質量。fidgi/o6ac^7'wwsp.屬于微小桿菌屬(五x/gwok^eWwm)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2237。圖1是生物除錳功能菌MB4C&^MO&c^/Mmsp.)的原子力顯微鏡圖片；圖2是生物除錳功能菌MB4(五;c/gwok"en'wwsp.)的原子力顯微鏡圖片；圖3是生物除錳功能菌MB4(^c/gwok^^^msp.)中類脂顆粒染色后觀察圖；圖4是生物除錳功能菌MB4(五:dgwo^c狄/wwsp.)中異染顆粒染色后觀察圖；圖5是生物除錳功能菌MB4(Ex/gwoto"eWwwsp.)去除水中Mr^+的時間曲線圖，圖5中"■"表示水中Mr^+濃度曲線，""表示Mr^+去除率曲線。具體實施方式具體實施方式一本實施方式生物除錳功能菌MB40&dgwok^eWwmsp.)屬于微小桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2237;生物除錳功能菌MB4(Ex/gMo6""er/wwsp.)為革蘭氏陽性微好氧菌，短桿菌，個體小，長為11.5pm，寬為0.50.8pm，細胞兩端鈍圓(如圖1和圖2所示)；在培養基上形成棕色菌落，不透明，中心顏色較深，四周顏色較淺，菌落為圓形；生物除錳功能菌MB4(^dgwoZ)acfen'wwsp.)具有能源貯存顆粒，無芽胞和莢膜，N,N,N',N'—四甲基對苯二胺(N,N，N'，N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽性。生物除錳功能菌MB4(五ja'gwo^"m'訓sp.)能在pH值為4~10的環境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除錳功能菌MB4(五x&wo6ac&n'wwsp.)趨向于形成35個或更多的細胞組成的鏈。具體實施方式二本實施方式生物除錳功能菌MB4(五x/gMo^cten'"msp.)是從遼寧省沈陽市張士生物除錳水廠的生物除錳濾池曝氣池壁取泥中篩選得到的。篩選用1L培養基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，O.lgMnS04.H20，0.1gK2HPO4，0.2gMgSO4.7H2O，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，O.lg(NH4)2C03,0.01gFeSO4'7H2O和余量的蒸餾水制成；然后滅菌。本實施方式采用平板劃線與平板涂布法相結合進行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ,DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)對分離所得菌種進行初篩。本實施方式采用TMPD法的原理是N,N,N',N'-四甲基對苯二胺(N,N,N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可與四價錳反應生成藍色物質WursterBlue,利用分光光度法通過測WursterBlue在"Onm處的OD值可推知菌落具有Mi^+氧化能力的強弱(菌落無顏色變化的為陰性、無生物除錳功能)。本實施方式生物除錳功能菌MB4(￡x/gwoZ^"en'wwsp.)16SrDNA測序工作由生物工程公司完成；其中PCR擴增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物BSR1541/20:5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，。本實施方式生物除錳功能菌MB4(fic/gwo6""en'wmsp.)16SrDNA序列如SEQIDNO.l所示。本實施方式生物除錳功能菌MB4(￡;'gwo6"c^7'wwsp.)生理生化分析結果如表l所示。表1生物除錳功能菌MB4生理生化實驗分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>生理生化實驗結果表明生物除錳功能菌MB4(^a'^ok^m'wmsp.)是微好氧菌株，可以在較寬pH范圍內生長，中性或偏堿性環境下生長更好；具淀粉酶和氧化酶；不具有脂肪酶、色氨酸酶、脫氨酶；沒有發酵葡萄糖產生乙酰四基甲醇的能力；不能在糖代謝過程中分解葡萄糖產生丙酮酸；生物除錳功能菌MB4(fia'gwo^"en'wwsp.)有脂質顆粒聚(3-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質顆粒PHB和異染顆粒Poly-P都屬于能源貯存顆粒。生物除錳功能菌MB4C&^"o^c/m'wmsp.)中脂質顆粒染色后觀察圖如圖3所示，生物除錳功能菌MB4(五;c/gwoZ^cfen'wwsp.)中異染顆粒染色后觀察圖如圖4所示。生物除錳功能菌MB4(五x/gwo6"cfe^wsp.)的發酵上清液具有較高的除錳活性，試驗表明生物除錳功能菌MB4(五;cgwote"en'i^sp.)能夠分泌大量的除錳胞外蛋白酶。接菌培養生物除錳功能菌MB4(五x/gwo6"c^7'wwsp.)，液體培養液pH值為7.5，在12t:低溫條件下培養48h，然后向培養液中加入高濃度Mr+溶液使培養液中Mr^+的濃度為24mg/L，液體培養液中Mr^+的濃度隨時間的變化曲線如圖5所示；36h內Mn"濃度迅速下降由24mg/L降至2.79mg/L，36h后趨于穩定維持在2.43mg/L左右；72h內Mi^+去除率高達91.25%。實驗證明，生物除錳功能菌MB4(五Wgwok^en'wwsp.)具有較高的生物除錳性能，且具有較高的胞外酶活性，通過48h的低溫培養菌株向胞外分泌大量活性蛋白，活性蛋白與Mi^+相結合，使M^+轉化為MnOx，得以去除。實施例8:藍藻生物菌發酵劑C的制備釆用實施例6的設備和步驟來制備藍藻生物菌發酵劑C,不同之處在于藍藻生物菌發酵劑C的組成以及各組分的重量配比為發酵用微生物菌組合物C:草炭秸稈-30kg:20kg:50kg。實施例9:藍藻生物菌發酵劑D的制備釆用實施例6的設備和步驟來制備藍藻生物菌發酵劑D,不同之處在于藍藻生物菌發酵劑D的組成以及各組分的重量配比為發酵用微生物菌組合物D:草炭秸稈=30kg:30kg:40kg。實施例10:藍藻發酵營養物A的制備(1)設備臥式螺旋翻動發酵池。(2)藍藻發酵營養物A的組成以及含有的各組分的重量配比為藍藻生物菌發酵劑A:藍藻=10kg:90kg。(3)制備步驟將實施例5制備的基料中的90kg藍藻放入臥式螺旋翻動發酵池內，加入實施例6制備的10kg藍藻生物菌發酵劑A并開動機器轉動攪拌，溫度保持在35°C~65。C之間，進行發酵96小時，每4小時翻料一次。待藍藻發酵好后，經烘千(溫度不超過60。C)至水分<10%后，粉碎成100目即得本發明的藍藻發酵營養物A。實施例ll:藍藻發酵營養物B的制備采用實施例10的設備和步驟來制備藍藻發酵營養物B,不同之處在于藍藻發酵營養物B的組成以及各組分的重量配比為藍藻生物菌發酵劑B:藍藻=20kg:80kg。實施例12:藍藻發酵營養物C的制備atgtggUtaattcgetetgcaacgcgeteigaaccttaccaactcttgacatcccattgaccg1020cttgagagatc犯gttttcccttcggggacaatggtgacaggtggtgcatggttgtxgtc1080agctcgtgtcgtg卿tgUgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatccttagtt1140gccagcattcagUgggcactctaggg卿ctgccggtgacaaaccggagg鄉gtgggg1200atgacgtcaaatcatcatgccccttatgagttgggctacacacgtgctac犯tgg3Cggt12603c3犯gggcagcg卿ccgcg鄉tggagccsatccc3t3aagccgttcccagttcggat1320tgcaggctgcaactcgcctgcatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaggtcagcatact薦gcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgcaac1440acccgaagccggtg郷ta3ccgc卿gagccagccgtcg卿gtggggt1500ggtg鄉tcgtaac犯ggtagccgtatcgg犯ggtgcggctggatcacctcctt1554<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.coli16SrRNA基因8~20bp設計PCR擴增」下向引物BSF8/20序列。<400>2agagtttgatcctggctcag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.coli16SrRNA基因152(M541bp設計PCR擴增iH向引物BSR1541/20序列。<400>3aaggaggtgatccagccgca20權利要求1、一種生物除錳功能菌，其特征在于生物除錳功能菌MB4(Exiguobacteriumsp.)屬于微小桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2237；生物除錳功能菌MB4(Exiguobacteriumsp.)為革蘭氏陽性微好氧菌，短桿菌，個體小，長為1～1.5μm，寬為0.5～0.8μm，細胞兩端鈍圓；在培養基上形成棕色菌落，不透明，中心顏色較深，四周顏色較淺，菌落為圓形；生物除錳功能菌MB4(Exiguobacteriumsp.)具有能源貯存顆粒，無芽胞和莢膜，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。2、根據權利要求1所述的一種生物除錳功能菌，其特征在于生物除錳功能菌MB4(五;dgwo&cfen'wwsp.)能在pH值為410的環境中生長，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。全文摘要一種生物除錳功能菌，它涉及一種微生物。它解決了目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化、啟動時間長和工程菌群遭到破壞后恢復周期長的問題。生物除錳功能菌MB4(Exiguobacteriumsp.)屬于微小桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2237；菌株MB4為革蘭氏陽性微好氧菌，短桿菌，個體小，長為1～1.5μm，寬為0.5～0.8μm，細胞兩端鈍圓；在培養基上形成棕色菌落，不透明，中心顏色較深，四周顏色較淺，菌落為圓形；菌株MB4具有能源貯存顆粒，無芽胞和莢膜，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。本發明生物除錳功能菌MB4具有去除水中Mn²⁺的能力，Mn²⁺去除率高于91％。文檔編號C12N1/20GK101215541SQ20081006381公開日2008年7月9日申請日期2008年1月7日優先權日2008年1月7日發明者杰張,冬李,焱趙申請人:哈爾濱工業大學