一種生物除錳除鐵功能菌的制作方法

專利名稱：：一種生物除錳除鐵功能菌的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物。技術背景水體中鐵的去除工藝較為成熟，單純具有除鐵功能的工程菌也比較多，但鐵和錳是地殼中含量豐富的金屬元素，僅將鐵去除遠遠不能滿足現有的水處理標準。普通水體中錳離子的濃度為0.1~lmg/L，而厭氧地下水中溶解性的錳離子濃度可高達7-9mg/L。可溶性錳經充氧曝氣能夠生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。、Mn02是高度不可溶物質(S—Mn02的溶解度kso僅為1(T56)，呈深黑色，可導致供飲用的地下水出現明顯的色度；因此飲用水中的錳必須去除。我國規定飲用水中錳離子的最高濃度為0.1mg/L，而歐盟已將飲用水中錳離子的最高濃度確定為0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴隨著錳離子的氧化、沉淀以及不溶性氧化產物的過濾分離。錳離子發生的非生物氧化反應如下一4她(u)]=b[她(u"+&[她(n)][她^表明Mn(II)的氧化伴隨著MnOx的自催化反應，這種自催化作用在飲用水錳處理工藝中較為重要。Mn(II)非生物氧化由氧作電子供體，通常在pH值大于9的條件下完成，低于9的pH條件下氧化反應速度極慢。絕大多數的飲用水pH在68之間，這種pH條件下Mn(II)不會發生氧化反應；因此飲用水中的錳不能通過簡單的曝氣和沉淀法去除。若加入化學藥劑(如KMn04和C102)雖然除錳效果較為理想，但增加了工藝運行費用、反應殘留物和生成的副產物，引起二次污染。生物氧化除錳具有良好的應用前景，但是目前生物氧化除錳主要利用自然選擇建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除錳效果差，而且水處理過濾速度慢、不能超過10m/h。現有水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化和啟動時間長；一旦工程菌群遭到破壞(中毒等原因導致工程菌死亡)其恢復周3期長，在此期間出水中錳含量劇增、出水質量難以保證，致使諄水處理設施不能正常運轉，嚴重的將威脅人民群眾的正常生活和生態環境。
發明內容本發明的目的是為了解決目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差，過濾速度慢；水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化、啟動時間長和工程菌群遭到破壞后恢復周期長的問題，而提供的一種生物除錳除鐵功能菌。生物除錳除鐵功能菌MS604C&go^cten'wmsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2240;生物除錳除鐵功能菌MS604CS^/z/"gokc/eWwmsp.)為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態桿菌，長為12pm，寬為0.30.4^im，細胞兩端圓鈍；在培養基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；生物除錳除鐵功能菌MS6040S;^'"gok^en'wmsp.)具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜，N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺(N,N，N，,N，-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽性。生物除錳除鐵功能菌MS604GS//n'"go6a"m'wmsp.)能在pH值為6~9的環境中生長，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。生物除錳除鐵功能菌MS604GS/^'"go^"m'訓sp.)細菌體內有類脂顆粒聚卩-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，PHB和Poly-P都屬于細菌細胞內的能源貯存顆粒，因此生物除錳除鐵功能菌MS604(^/n'"go^"en'簡sp.)可以更好的適應低溫、貧營養生長環境，具有惡劣環境適應能力強的優點。本發明生物除錳除鐵功能菌MS604通過16SrDNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是鞘氨醇桿菌屬的5^/'"goZwcfen'wwsp.CI01(GenbankDQ530064.1)，同源性為97%，因此被命名為5^/7/wgo&cfen'wwsp.。本發明生物除錳除鐵功能菌MS604具有去除水中Mr^+和F^+的能力，Mi^+去除率高于79%，Fe"去除率率高于90%。本發明生物除錳除鐵功能菌MS仞《5^2/"^^ac^n'wmsp.)的生化能力強、除錳、除鐵效果好，可以直接投入使用，不僅縮短了水處理除錳除鐵生物濾池的建立時間，也可加快過濾速度，并且縮短了工程菌群遭到破壞后的恢復周期，可以在短暫的3~4小時內恢復水處理設施正常運行，保證了出水的質量。S;W"go^cfen'wmsp.屬于鞘氨醇桿菌屬(Sp/n'wgo^cfen^附)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2240。圖1是生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/wgoZw"en'^7sp.)中異染顆粒染色后觀察圖，圖2是生物除錳除鐵功能菌MS604CSp/z/"go^c^/畫sp.)芽胞染色后觀察圖，圖3是生物除錳除鐵功能菌MS604CS/7/H'"go&cfen'wwsp.)中類脂顆粒染色后觀察圖，圖4是生物除錳除鐵功能菌MS604(S/7/z/"go^c^7'wmsp.)莢膜染色后觀察圖，圖5是生物除錳除鐵功能菌MS604C/"go&cfen'謂sp.)去除水中Mn2+的時間曲線圖，圖6是生物除錳除鐵功能菌MS604(5^2/"gokz"m'wwsp.)去除水中Mn2+的pH值關系曲線圖，圖7是生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/z/wgo^c^/調sp.)培養時間與菌液濁度關系曲線，圖8是生物除錳除鐵功能菌MS604CS^^go&cfm'wmsp.)去除水中Fe"的時間曲線圖。具體實施方式具體實施方式一本實施方式生物除錳除鐵功能菌MS604CSp/n'"go^"m'Wmsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo,2240;生物除錳除鐵功能菌MS604GSp/2/"go&cfen'畫sp.)為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態桿菌，長為l~2pm，寬為0.3~0.4pm，細胞兩端圓鈍；在培養基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；生物除錳除鐵功能菌MS6040Sp/2/"gOk^&WMmsp.)具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜(如圖2和圖4所示)，N,N，N',N'—四甲基對苯二胺(N,N,N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色為陽性。生物除錳除鐵功能菌MS604(S//H'"go&"m^msp.)能在pH值為69的環境中生長，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/n'"gok7cteWwwsp.)單個或成簇排列，菌落大。具體實施方式二本實施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/7/"go^"m'訓sp.)是從遼寧省沈陽市張士生物除錳水廠的生物除錳濾池曝氣池壁取泥中篩選得到的。篩選用1L培養基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，O.lgMnS04.H20，0.1gK2HPO4，0.2gMgS04'7H20，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，0.1g(NH4)2CO3，O.OlgFeS04'7H20和余量的蒸餾水制成；然后滅菌。本實施方式采用平板劃線與平板涂布法相結合進行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ,DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)對分離所得菌種進行初篩。本實施方式采用TMPD法的原理是N，N,N',N'-四甲基對苯二胺(N，N，N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可與四價錳反應生成藍色物質WursterBlue,利用分光光度法通過測WursterBlue在420nm處的OD值可推知菌落具有Mn"氧化能力的強弱(菌落無顏色變化的為陰性、無生物除錳功能)。本實施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/"gok^en'wwsp.)16SrDNA測序工作由生物工程公司完成；其中PCR擴增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,，反向引物BSR1541/20:5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。本實施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(S;/7/"go^c^"/wmsp.)16SrDNA序列如SEQIDNO,l所示。本實施方式生物除錳除鐵功能菌MS604(&/7/wgok^eWwmsp.)生理生化分析結果如表1所示。表1生物除錳除鐵功能菌MS604生理生化實驗結果試驗名稱試驗結果結果所說明的問題乙酰甲基醇試驗一沒有發酵葡萄糖產生乙酰四基甲醇的能力。甲基紅試驗一不能在糖代謝過程中分解葡萄糖產生丙酮酸。淀粉水解試驗—不能產生能夠水解淀粉的淀粉酶。產氨試驗--不能產生脫氨酶<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>生理生化實驗結果表明生物除錳除鐵功能菌MS604(S;/H77go^c欣Z謂sp.)是好氧菌，適于在中性或堿性環境中生長；O'C低溫條件下仍可生長，典型低溫菌種；具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶；可將水中的脂肪分解成甘油和脂肪酸，沒有發酵葡萄糖產生乙酰四基甲醇的能力，不能在糖代謝過程中分解葡萄糖產生丙酮酸。生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/z/"go^c^7'wwsp.)有脂質顆粒聚卩-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質顆粒PHB和異染顆粒Poly-P都屬于能源貯存顆粒。生物除錳除鐵功能菌MS604CS//z/"go^"m'訓sp.)中脂質顆粒染色后觀察圖如圖3所示，生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/"go6""m^wsp.)中異染顆粒染色后觀察圖如圖1所示。生物除錳除鐵功能菌MS604CS//n'wgo6acfen'wwsp.)的發酵上清液具有較高的除錳活性，試驗表明生物除錳除鐵功能菌MS604(S—/"go6a"m'訓sp.)能夠分泌大量的除錳胞外蛋白酶。接菌培養生物除錳除鐵功能菌MS604CS//7/"gok^en'wmsp.)，液體培養液pH值為7.5，在lrC低溫條件下培養48h，然后向培養液中加入高濃度Mn^溶液使培養液中Mi^+的濃度為9mg/L，液體培養液中Mr+的濃度隨時間的變化曲線如圖5所示；1224hMn"濃度有大幅度消減，由8.47mg/L降至2.98mg/L。24h后消減程度略趨平緩，直到48h后趨于穩定(2.35mg/L)，之后維持在2mg/L左右，到72h時，Mn"去除率達到79.08%。1。實驗證明，生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/7/wgo^cfen'wmsp.)具有較高的生物除錳性能，且具有較高的胞外酶活性，通過48h的低溫培養菌株向胞外分泌大量活性蛋白，活性蛋白與Mr+相結合，使Mi^+轉化為MnOx，得以去除。由圖6可知，生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/2/"go^c^7'應sp.)的最佳活性pH值為8，生物除錳除鐵功能菌MS604(Sp/z/"go6"cten'wwsp.)在pH值為14的環境中幾乎無法去除Mn2、主要因為較低的pH環境不適合菌株生長，同時對酶活有抑制作用；pH值大于4去除率開始迅猛增長；pH值大于9Mi+去除率雖然略有下降，但仍保持在較高的范圍內，雖然生理生化試驗表明值pH大于10生物除錳除鐵功能菌MS604(&WMgok^m^msp.)根本不能生長，但由于Mn2+在pH〉9.5的堿性環境下可以被溶解氧迅速氧化成Mn02而析出，因此pH為10~14時Mr^+去除率仍高達75%左右。考察菌濁度的目的是確定MS604的生長周期，為工程應用提供指導性的參數。由圖7可知接種時原始菌濁度(OD值)為0.12，接種后12h內細菌數量迅速增加，OD值高達0.6;之后的36小時內出現明顯的波動狀態，菌濁度在經過迅速下降-迅速上升-下降的變化后趨于平穩，穩定在OD值0.48左右。這種無規律的變化曲線很難準確測出MS604的生長曲線。在培養過程中發現接種12h后，培養液底部出現細菌聚集現象，這可能是因為MS604胞外存在莢膜和粘液，使較高濃度的細菌在相互接觸過程中形成菌膠團。因而測定OD值時，細菌分布不均勻，導致數值的不真實可靠。由此可見，使用常規方法，即通過測菌濁度，確定生長曲線的方法對生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/z/"go6<3cte/-/wmsp.)不適合。接菌培養生物除錳除鐵功能菌MS604(5^/z/"go^c欣/wwsp.)，液體培養液pH值為7.5，在12。C低溫條件下培養48h，然后向培養液中加入高濃度Fe2+溶液使培養液中Fe^的濃度為14mg/L，液體培養液中Mi+的濃度隨時間的變化曲線如圖8所示，12h內F^+去除率迅速增高，去除率高達72.69%，Fe2+濃度由Mmg/L降至6.56mg/L，24h后去除率趨于穩定，Fe^去除率維持在90%左右。序列表<110>哈爾濱工業大學<120>—種生物除錳除鐵功能菌<160>3<210〉1<211>1522<212>DNA<213〉生物除錳除鐵功能菌MS604(&W"go^c^7'wmsp.)<220><223>生物除錳除鐵功能菌MS60416SrDNA基因序列<400〉1犯gg鄉tg3atcggttttaggcttgacggcgattactagtggcttttagcacgtgtgtactgtttgcacgggttgcgctgcagcaccta鄉cccgggtgggcccccgttaacgctttccgtggactactaccagcttagctacttgtcgcgatggttgtccagccgcaccctaacacggcggtgtgtaCg3atCC33Cagattagcatgccccggacgaggcagtctgcgttgcgggagtttcgtgtc犯ggttcctccaattcctttgct犯gacgccagggtatctgtg昭ctgccttattccgccagccaccgtaccttccggtactccttgcggc犯ggcccggttcstggggtcatattgctat犯gggccattttagagtcccttaacccaaccg犯ggacggCgt已tC3tCgagtttcacctggctgtctaaatcctgttcttcgc犯tcgcacttcaaattttcacccctcggctacctttcacatgcttgaacgtattccgsgttg卿tgtagctgccgstgacttgsccaccattaccacctcacggagaccgtctcg犯ttaaacccttgcgggcgtcgccaacstgatccccacgg恥ttctaBgggattcaagcg￡LCtt￡Lait￡tggttacgactttaggtaccccaccgcgtcatacccc3atcccgctgtaccacgtcgcccccatgctggcaacacgagctgatggtctcttcacatgctccttactccccagCg3gtt3tC3ctttcgtgcaacatatctatccatcagtatgccgcctacgagccccaatt60caactttcat120tgctgatacg180gaactgtgaa240tccattgtag300accttcctca360ctaaacatag420cgacagccat480actaactttc540ccgcttgtgc600gtggataact660tcgtttaggg720tcagcgtcaa780gcatttcacc840caaaggcact900cacccttt肌960acccaataaatccggat犯cgctcggatcctagccgatccttattcttccagtacattcagtttacaacccatagggcsgcttccgcccattgaccaatattccttactgcagtaccagtgtgggggattctcctctcaggttaccctacc犯ctagctaatgtcacgcgatatcccgatgccggtacattatattatgcCCCtg3t犯3ggt鄉ttgctcacgcgtt3agcaagctctgattccaatcccgtccgacttcctgagccaggatc犯actct1522tccgtattaccgcggctgctggcacggagt翻gctaaatacscgt3tttaggtttattcctg1080tcatcctgcacgcggcatggctggttc鄉1140ctgcctcccgtaggagtctggtccgtgtct1200agcccctagacatcgtcgccttggt犯gcc1260agcccatctctatcctataaatatttaata1320ggtgtt犯tctctctttcgag3ggCt3tCC1380cgcacccgtgcgccactctcatggaaccag1440tgcatgtatt鄉cctgccgctagcgttca1500<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.coli16SrRNA基因8~20bp設計PCR擴增正向引物BSF8/20序列。<400>2卿gtttgatcctggctcag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據E.coli16SrRNA基因152(M541bp設計PCR擴增正向引物B《R1541/20序列。<400>3aaggaggtgatccagccgca2010權利要求1、一種生物除錳除鐵功能菌，其特征在于生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2240；生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態桿菌，長為1～2μm，寬為0.3～0.4μm，細胞兩端圓鈍；在培養基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。2、根據權利要求1所述的一種生物除錳除鐵功能菌，其特征在于生物除錳除鐵功能菌MS604CSp/z/"go6""m'M/wsp.)能在pH值為6~9的環境中生長，具有脂肪酶和硝酸鹽還原性，不具有色氨酸酶、氧化酶、脫氨酶和淀粉酶。全文摘要一種生物除錳除鐵功能菌，它涉及一種微生物。它解決了目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養、馴化、啟動時間長和工程菌群遭到破壞后恢復周期長的問題。生物除錳除鐵功能菌MS604(Sphingobacteriumsp.)屬于鞘氨醇桿菌屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號為CGMCCNo.2240；菌株MS604為革蘭氏陰性好氧菌，為多形態桿菌，長為1～2μm，寬為0.3～0.4μm，細胞兩端圓鈍；在培養基上形成乳黃色菌落，菌落圓形，不透明，邊緣整齊；菌株MS604具有能源貯存顆粒，有芽胞和莢膜，N，N，N’，N’-四甲基對苯二胺染色為陽性。本發明生物除錳除鐵功能菌MS604具有去除水中Mn²⁺和Fe²⁺的能力，Mn²⁺去除率高于79％，Fe²⁺去除率率高于90％。文檔編號C12R1/01GK101260376SQ20081006381公開日2008年9月10日申請日期2008年1月7日優先權日2008年1月7日發明者杰張,冬李,焱趙申請人:哈爾濱工業大學