專利名稱：一株產芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于本發明屬于生物技術領域，涉及ー種產芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株 fmb_103o
背景技術：
染料エ業是國民經濟中的重要行業，其生產的染料被廣泛應用于紡織、造紙、食品、皮革、化妝品、涂料、油漆、油墨、電子エ業等各個領域。染料品種數以萬計，在生產和使用過程中大約有109^20%的染料會直接隨廢水進入環境中。大多數染料為有毒難降解有機
物，化學穩定性強，含有重金屬，有刺激性、致敏性、急性毒性，具有致癌、致畸、致突變作用，直接危害人類健康；此外，廢水中的染料能吸收光線，降低水體的透明度，對水生生物、微生物的生長不利，并且降低了水體的自浄能力，同時導致視覺污染，還會嚴重破壞水體、土壌及生態環境，影響食品質量與安全，間接危害人體健康。三苯甲烷類染料是ー種多苯環化合物，使用面較廣，用量也較大，其產量被列為第三大主要染料。其中某些染料及中間降解產物具有“三致”作用，從生產、運輸、使用等環節進入環境，這勢必造成污染，為生態環境帶來沖擊。并且這類染料中的一部分難以降解，常常導致常規的生物處理系統處理效果不夠理想，因此，對三苯甲烷類染料生物降解性能進行系統的研究，成為處理這類染料廢水重要的一方面。行之有效的染料廢水處理方法和技術是改善生態環境、保證食品安全和維護人類健康的重要保證。目前，常用的染料廢水處理方法有物理方法、化學方法和生物方法。物理化學處理法雖然對廢水色度去除率較高，但COD去除率較低，且存在處理費用高、可能引起二次污染等問題。生物法即通過篩選或構建具有高效性能的特定微生物菌株用于染料廢水的脫色，是ー種經濟、有效且適于大規模廢水處理的技木。生物方法對染料的脫色主要通過降解和生物吸附兩方面發揮作用，降解是由微生物分泌胞外氧化酶-木質素降解酶系統進行脫色，包括漆酶、木素過氧化物酶和錳過氧化物酶等；而吸附主要是通過菌體的自身結構與染料等大分子物質相契合所致。因此，對用于染料的生物脫色方法通常以微生物和酶為載體進行研究。目前研究發現的染料脫色酶主要有漆酶(Laccase)、木質素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)，它們對底物的降解具有廣譜性，對染料的脫色及降解效果明顯，具有很好的應用前景。漆酶是ー類含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于自然界中，主要包括植物漆酶和真菌漆酶，蛋白質數據庫和細菌基因組序列分析的結果證明漆酶也廣泛存在于細菌中。漆酶作為ー種生物制劑，具有高效、專一、作用條件溫和等特點，在紙漿生物漂白、染料的脫色及其廢水凈化、污染物質脫毒與降解等方面有著巨大的應用潛力。而且，在還原介質的存在下，可進ー步的擴大漆酶的底物范圍。采用漆酶直接對染料進行脫色降解，以及利用漆酶介體系統，漆酶染料中間體和固定化漆酶對染料降解的研究已引起了國內的脫色降解效果。然而，大量關于漆酶的研究工作取材于真菌，分泌漆酶的真菌主要集中于擔子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)及半知菌類(Imperfect fungi)等真菌，其中最主要的是擔子菌門中的白腐真菌。但是真菌較細菌生長緩慢、發酵周期長、生長溫度和PH范圍狹窄等特性，必然導致真菌在產酶數量、酶學性質等多方面體現出劣勢。細菌漆酶比真菌漆酶有更多的優點，如存在Cu2+抗性、不需糖基化、熱穩定性好及酶活性的最適pH值范圍廣等。同時，細菌生長的代時短，所需營養成分簡單易得，便于大規模培養；大多數細菌生長在堿性環境中，篩選出最適PH在堿性范圍內的細菌漆酶，可以直接用于處理工業廢水；細菌漆酶對熱、鹵素和堿的穩定性好，因此，細菌漆酶的研究對漆酶應用的環境條件和領域的擴展具有十分重要的意義。而目前關于細菌漆酶的研究很少，更多具有高效脫色能力細菌漆酶還有待于進ー步發掘和研究。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一株產芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌。 本發明的另ー目的是提供該死亡谷芽孢桿菌應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現一株產芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)fmb-103,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年06月08日，保藏號為CGMCCNo. 6198。所述的保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103在降解三苯甲烷類染料中的應用。優選利用保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103產生的芽孢漆酶在降解三苯甲烷類染料中的應用。其中，所述的三苯甲烷類染料優選孔雀石綠、亮綠、苯胺藍中的任意ー種或多種。所述的芽孢漆酶優選主要通過如下步驟制備a.將保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103接種于IOOmL BPY種子液培養基，37°C，180rpm，培養12 16小時得種子液；b.按3%的接種量將種子液轉接到發酵培養基中，37°C，180rpm，發酵48小吋，所述的發酵培養基配方為玉米粉4. 65g/L，黃豆粉5. 88g/L，MgS042 . 53g/L，MnSO4O. lg/L，K2HPO4O. 3g/L, FeSO4O. 5g/L, pH 7. 0 ；c 取出發酵液，濾紙抽濾，棄去菌體；d.抽濾液10000 12000rpm離心25 30min,棄去上清，沉淀物用去離子水重懸，1000(Tl2000rpm離心l(Tl5min，重復兩次，所得沉淀物即為所述的芽孢漆酶。ー種利用保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103降解三苯甲烷類染料的方法，在0. 2mol/LpH6. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，加入終濃度為0. lmol/L的介體2，2’-連氮-ニ(3-こ基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛或こ酰丁香酮，5. 38U/mL fmb_L820和50mg/L的三苯甲烷類染料，于37°C下靜置反應48h ;其中所述的fmb_L820為保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103產生的芽孢漆酶。所述的保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103產生的芽孢漆酶主要通過如下步驟制備a.將保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103接種于IOOmL BPY種子液培養基，37°C，180rpm，培養12 16小時得種子液；b.按3%的接種量將種子液轉接到發酵培養基中，37°C，180rpm，發酵48小時，所述的發酵培養基配方為；c.取出發酵液，濾紙抽濾，棄去菌體；d.抽濾液10000 12000rpm離心25 30min,棄去上清，沉淀物用去離子水重懸，1000(Tl2000rpm離心l(Tl5min，重復兩次，所得沉淀物即為所述的芽孢漆酶。所述的三苯甲烷類染料優選自孔雀石綠、亮綠、苯胺藍中的任意ー種或多種。有益效果本發明提供了一種產細菌芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株fmb-103(CGMCC No. 6198)，此類菌株是首次被發現具有產生芽孢漆酶的能力。利用該 菌株產生的芽孢漆酶，在介體的作用下，能夠高效的催化三苯甲烷類染料(孔雀石綠、亮綠和苯胺藍)的降解。利用fmb-103，通過簡單的發酵和分離手段獲得大量芽孢漆酶，應用于染料降解，對于緩解染料エ業帶來的環境問題具有重要的現實意義。
圖I菌株fmb-103的菌落生長形態圖2菌株fmb-103革蘭氏染色圖3基于16S rRNA基因序列的fmb-103菌株的系統發育樹
圖4芽孢漆酶對染料的脫色效應其中，CK.染料；A.漆酶+染料；B. ABTS+染料；C. 丁香醛+染料；D.こ酰丁香酮+染料；E.漆酶+ABTS+染料；F.漆酶+ 丁香醛+染料；G.漆酶+こ酰丁香酮+染料。圖5芽孢漆酶對染料的脫色效率其中，a.漆酶；b.漆酶+ABTS ；c.漆酶+ 丁香醛；d.漆酶+こ酰丁香酮圖6pH對芽孢漆酶染料脫色影響(A)pH對芽孢漆酶對孔雀石綠脫色影響；(B)pH對芽孢漆酶對亮綠脫色影響；(C)pH對芽孢漆酶對苯胺藍脫色影響；其中，a.漆酶；b.漆酶+ABTS ；c.漆酶+ 丁香醛；d.漆酶+こ酰丁香酮圖7孔雀石綠降解的全波長掃描生物材料保藏信息本發明提供的該菌株為死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)fmb-103,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，縮寫CGMCCJii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No. 6198，保藏日期為2012年06月08日。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進ー步的闡述。實施例I產芽孢漆酶死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) fmb-103的獲得將來源于印染エ廠污染的土壤樣品IOg在無菌條件下，加入到250mL帶有玻璃珠并已滅菌的富集培養基內(富集培養基組分1% (W/V)胰蛋白胨；0. 5% (W/V)酵母粉；1%(W/V) NaCl ;終濃度 0.2mmol/L CuSO4X 37°C，200rpm 震蕩 24_48h，進行富集培養基。培養結束后，10000rpm、4°C條件下離心lOmin，獲得上清液進行梯度稀釋，得到10'10_2、10'10_4、10_5、10_6、10' 10_8、10_9的稀釋倍數。每ー梯度100 u L菌液滴加于營養瓊脂平板(營養瓊脂平板組分10. Og/L蛋白胨；3. Og/L牛肉粉；5. Og/L氯化鈉；15. Og/L瓊脂；IOOOrnl蒸餾水；pH值7. 3±0. I)后涂布，37°C培養2-4天。取含有單菌落平板，在菌落及其周圍滴加lmm/L的ABTS，若在滴定區域顯現綠色表示有漆酶存在。挑取使ABTS溶液發生顏色變化的單菌落，進行多次重復驗證，獲得具有漆酶活性的菌株，命名為fmb-103，送交CGMCC保藏，保藏號為 CGMCCNo. 6198。實施例2產芽孢漆酶死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) fmb-103菌株的
鑒定(I)菌株形態學鑒定死亡谷芽孢桿菌fmb-103 (CGMCC No. 6198)菌株接種于營養瓊脂培養基上，30°C培養24h，特征觀察結果如表1，菌落形態見圖1，革蘭氏染色結果見圖2。表I菌株fmb-103的培養特征觀察結果
權利要求
1.一株產芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis) fmb-103,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年06月08日，保藏號為CGMCC No. 6198。
2.權利要求I所述的保藏號為CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103在降解三苯甲烷類染料中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于利用保藏號為CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103產生的芽孢漆酶在降解三苯甲烷類染料中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的三苯甲烷類染料選自孔雀石緑、亮綠、苯胺藍中的任意ー種或多種。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的芽孢漆酶主要通過如下步驟制備 a.將保藏號為CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103接種于IOOmL BPY種子液培養基，37°C，180rpm，培養12 16小時得種子液； b.按3%的接種量將種子液轉接到發酵培養基中，370C，180rpm,發酵48小時，所述的發酵培養基配方為玉米粉 4. 65g/L，黃豆粉 5. 88g/L，MgSO4 2. 53g/L，MnSO4 0. lg/L，K2HPO40. 3g/L, FeSO4 0. 5g/L, pH 7. 0 ； c.取出發酵液,濾紙抽濾,棄去菌體； d.抽濾液10000 12000rpm離心25 30min,棄去上清，沉淀物用去離子水重懸，10000 12000rpm離心10 15min，重復兩次，所得沉淀物即為所述的芽孢漆酶。
6.ー種利用權利要求I所述的保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103降解三苯甲烷類染料的方法，其特征在于在0. 2mol/LpH6的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，加入終濃度為0. lmol/L的介體，5. 38U/mL fmb_L820和50mg/L的三苯甲烷類染料，于37°C下靜置反應48h，所述的介體選自2，2’ -連氮-ニ(3-こ基苯并噻唑-6-磺酸)、丁香醛或こ酰丁香酮中的任意ー種；其中所述的fmb-L820為保藏號為CGMCC No. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103產生的芽孢漆酶。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的保藏號為CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103產生的芽孢漆酶主要通過如下步驟制備 a.將保藏號為CGMCCNo. 6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103接種于IOOmL BPY種子液培養基，37°C，180rpm，培養12 16小時得種子液； b.按3%的接種量將種子液轉接到發酵培養基中，37°C，180rpm，發酵48小時，所述的發酵培養基配方為玉米粉 4. 65g/L，黃豆粉 5. 88g/L，MgSO4 2. 53g/L，MnSO4 0. lg/L, K2HPO40. 3g/L, FeSO4 0. 5g/L, pH 7. 0 ； c.取出發酵液,濾紙抽濾,棄去菌體； d.抽濾液10000 12000rpm離心25 30min,棄去上清，沉淀物用去離子水重懸，10000 12000rpm離心10 15min，重復兩次，所得沉淀物即為所述的芽孢漆酶。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的三苯甲烷類染料選自孔雀石緑、亮綠、苯胺藍中的任意ー種或多種。
全文摘要
本發明屬于本發明屬于生物技術領域，涉及一種產芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)菌株fmb-103。產芽孢漆酶的死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)fmb-103，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年06月08日，保藏號為CGMCC No.6198。所述的保藏號為CGMCC No.6198的死亡谷芽孢桿菌fmb-103能夠產芽孢漆酶可在降解三苯甲烷類染料中的應用。
文檔編號C02F3/34GK102757909SQ201210204548
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者刁含文, 別小妹, 呂鳳霞, 張充, 王昱灃, 趙海珍, 陸兆新 申請人:南京農業大學